Применение ультрафильтрации в производстве вакцины против бешенства человека

Чтобы способствовать применению ультрафильтрации в производстве человеческой вакцины против бешенства, использовалась мембранная кассета ультрафильтрации 300 кДа для концентрирования раствора сбора вируса бешенства и определения восстановления антигена, скорости удаления эндотоксина и скорости удаления белка-хозяина после ультрафильтрации. Результаты показали, что при соответствующем давлении раствор для сбора вируса бешенства концентрировался 80 раз, элюировался 25 раз, степень восстановления антигена составляла 86,2%, степень удаления бактериального эндотоксина составляла 87,5% ~ 88,7% и степень удаления белка-хозяина составила 91,6%.

 

Предисловие

 

Бешенство – традиционное, древнее зоонозное заболевание, вызываемое вирусом бешенства (ВР), с летальностью до 100%. В настоящее время не существует эффективного лечения постконтактного заражения (т.е. повреждения кожи и слизистых оболочек), кроме экстренной вакцинации и вакцинации иммуноглобулином. Основным источником заражения человека бешенством являются укусы больных или потенциально зараженных животных (преимущественно собак). По смертности от бешенства в Китае занимает второе место в мире, и бешенство является одной из проблем, угрожающих безопасности общественного здравоохранения в нашей стране. Капсульный гликопротеин вируса бешенства, который является единственным ключевым антигеном, индуцирующим выработку защитных нейтрализующих антител, был в центре внимания исследований и разработок новых вакцин, а также новых технологий диагностики и лечения вируса бешенства.

 

Вирус бешенства относится к роду вирусов бешенства семейства рабдовирусов. Форма нуклеокапсида эластичная, нуклеокапсид спирально-симметричный, на поверхности имеется оболочка, содержащая одноцепочечную РНК. Это возбудитель, вызывающий бешенство. Вирус бешенства имеет два основных антигена: один - это гликопротеиновый антиген на внешней мембране вируса, который может связываться с рецептором ацетилхолина, делая вирус нейротоксичным, и продуцировать в организме нейтрализующие антитела и антитела, ингибирующие гемагглютинацию. защитный эффект; Другой — внутренний рибопротеиновый антиген, который может заставлять организм вырабатывать антитела, связывающие комплемент, и преципитин, но не оказывает защитного эффекта.

 

Эндотоксин представляет собой разновидность липополисахаридного вещества (ЛПС), которое обладает термостойкостью и химической стабильностью и не поддается легкому разрушению. Если в вакцине будет определенная концентрация эндотоксина, это вызовет сильную лихорадку и даже смерть после вакцинации, поэтому содержание эндотоксина в вакцине следует максимально снизить. Издание Китайской фармакопеи 2005 года (часть III) определило, что контрольное значение квалифицированного индекса эндотоксина вакцины против бешенства не должно превышать 100 EU/дозу. В связи с быстрым развитием технологии мембранного разделения применение технологии ультрафильтрационного мембранного разделения для снижения содержания эндотоксина в вакцинах получает все большее распространение в фармацевтической промышленности.

 

Вакцина против бешенства – это вакцина против бешенства. Обычно существует три типа вакцин против бешенства, включая очищенную клеточную вакцину Vero, вакцину на диплоидных клетках человека и вакцину на первичной клеточной культуре. Вакцину против бешенства изготавливают путем инокуляции фиксированного вируса бешенства в клеточный матрикс после культивирования, сбора, концентрирования, инактивации, очистки и добавления соответствующего стабилизатора. Основная функция вакцины против бешенства — стимулировать организм к быстрому иммунному ответу и выработке защитных антител против вируса бешенства, чтобы предотвратить инфекцию, вызванную вирусом, и снизить риск заболевания.

 

 

Процесс производства вакцины играет важную роль в обеспечении качества вакцины, особенно более важна количественная оценка некоторых показателей в процессе производства. В процессе производства человеческой вакцины против бешенства технология ультрафильтрационного концентрирования является необходимым средством производства человеческой вакцины против бешенства. Использование ультрафильтрационной мембраны с разумной апертурой для ультрафильтрационной концентрации позволяет эффективно удалять эндотоксин и белок-хозяин и сохранять антиген РВ, что способствует производству вакцин и улучшению качества. Относительная молекулярная масса молекул РВ составляет 350–460 кДа, и теоретически РВ можно полностью улавливать путем ультрафильтрационной концентрации с использованием мембранной кассеты с молекулярной массой перехвата 100 кДа и 300 кДа. Эндотоксин часто образует агрегатную структуру в разных водных растворах, из-за степени агрегации размер молекул различен. Относительная молекулярная масса мономера эндотоксина составляет 10–20 кДа, а относительная молекулярная масса его полимеризационной формы составляет 300–1000 кДа или более 1000 кДа. Учитывая разницу в молекулярной массе, антиген RV в человеческой вакцине против бешенства сохранялся, а эндотоксин и белок-хозяин в человеческой вакцине против бешенства удалялись с помощью ультрафильтрационной мембраны 300 кДа.

 

В этом эксперименте кассета с ультрафильтрационной мембраной с апертурой 300 кДа и площадью мембраны 0,11 м2 использовалась в качестве обработки небольшого образца для концентрации промежуточных продуктов человеческой вакцины против бешенства, а также потока мембраны, эффективности обработки, многократной концентрации, перехвата антигена, удаления эндотоксина. и удаление белка-хозяина были протестированы.

 

2Материальный метод

 

2.1 Экспериментальные материалы

Фиксированный штамм вируса бешенства CTN-IV; клетки Веро; 0.5М гидроксид натрия; Кассета с ультрафильтрационной мембраной 300 кДа (материал PES, площадь мембраны 0,11 м²).

 

2.2 Экспериментальные методы

2.2.1 Приготовление раствора для сбора вируса

Замороженные клетки Vero реанимировали в теплой воде при температуре 37–39 градусов, клеточную суспензию отсасывали, а затем добавляли в культуральную среду 199, содержащую 10% инактивированной телячьей сыворотки. Однородные монослойные клетки культивировали при 37 градусах. Штамм CTN-IV инокулировали вирусом бешенства в соотношении 0,1 моль/л и культивировали при 37 градусах. Через 48 часов культуральную среду выбрасывали и добавляли культуральную среду 199, содержащую 0,1% альбумина человеческой крови, для поддержания культуры при температуре 33–35 градусов. Собирайте яд болезни раз в 3 дня-5дня и объединяйте несколько жидкостей для сбора.

 

2.2.2 Установка мембранной кассеты

Установите мембранную кассету и подсоедините проводку, как показано на рисунке ниже.

 

2.2.3 Промывка водой

Закройте впускной клапан, обратный клапан и проходной клапан и вставьте обратный конец и проходную трубу в резервуар для отработанной жидкости. Заполните приемный резервуар 1 л воды для инъекций.

Откройте впускной и обратный клапаны, закройте проходные клапаны, откройте насос, очистите возвратную линию 10% объема очищенной воды или воды для инъекций и поддерживайте давление на входе на уровне 0,35 бар (5 фунтов на квадратный дюйм).

Откройте клапан фильтра, закройте обратный клапан и используйте оставшуюся нагнетаемую воду для очистки трубки фильтра, поддерживая TMP на уровне 0,35 бар.

 

2.2.4 Дезинфекция

Закройте впускной клапан, обратный клапан и клапан передачи и вставьте линии возврата и конца передачи в бак для отработанной жидкости. Заполните приемный резервуар 2 л ​​чистящего раствора.

Откройте впускной и обратный клапаны, закройте проходные клапаны, откройте насос, очистите возвратную линию 200мл 0,5 М гидроксида натрия и поддерживайте давление на входе на уровне 0,35 бар (5 фунтов на квадратный дюйм). .

Откройте проходной клапан, закройте обратный клапан и очистите проходную трубу чистящим раствором объемом 200 мл, поддерживая давление TMP на уровне 0,35 бар.

Затем обратный конец и проходная концевая труба вставляются в резервуар для жидкости для циклической очистки. Цикл очистки со скоростью тангенциального потока, в 1–1,5 раза превышающей процесс, в течение 30 минут.

Слейте 0.5M гидроксида натрия и промойте водой для инъекций в соответствии с 2.2.4 до нейтральной реакции.

 

2.2.5 Испытание водного потока

Добавьте очищенную воду в приемный резервуар, измерьте и запишите температуру воды в приемном резервуаре. Вставьте обратный конец в резервуар. Запустите насос и отрегулируйте скорость насоса и обратный клапан, чтобы добиться перепада трансмембранного давления 0,35 бар (5 фунтов на квадратный дюйм). Используя цилиндр, измерьте и запишите скорость потока на проходном конце в мл/мин. Отрегулируйте скорость насоса и обратный клапан, чтобы получить трансмембранный перепад давления 1 бар (15 фунтов на квадратный дюйм). Используя цилиндр, измерьте и запишите скорость потока на проходном конце в мл/мин.

Чтобы стандартизировать значение расхода воды, разделите рассчитанное значение расхода воды на разницу трансмембранного давления и умножьте поправочный коэффициент температуры, указанный в следующей таблице.

 

2.2.6 Ультрафильтрационная концентрация

Вымойте воду из системы с помощью буферной крышки. Выполните цикл в течение 5 минут, чтобы отрегулировать pH и ионную стабильность системы. Если температуру необходимо отрегулировать, продолжайте цикл, пока температура системы не станет стабильной.

Добавьте питательную жидкость во впускной резервуар, установите скорость потока подачи (например, 400LMH) и проверьте скорость сквозного потока при различных значениях TMP. По данным испытаний были построены кривые с ТМП по оси абсцисс и потока по ординате.

Направьте проходную трубу в подходящий контейнер или канализацию, например, в проходные резервуары для сбора отходов, резервуары для сточных вод и технологические стоки.

Запишите первоначальный вес питательной жидкости в питательном резервуаре, запустите питательный насос и медленно циркулируйте питательную жидкость в течение 3–4 минут. Рециркуляция может помочь удалить остаточный воздух на пути потока, тем самым максимизируя производительность пленки.

Откройте проходной клапан, медленно увеличивайте скорость насоса до достижения оптимального тангенциального расхода и отрегулируйте обратный клапан для достижения оптимального ТМР системы.

Затем поместите трубку в контейнер для сбора, начните отсчет времени, когда жидкость попадает в контейнер, и запишите давление на входе и возврате через соответствующие промежутки времени, а также запишите качество жидкости с течением времени на возвратном и проходном концах, чтобы вычислить мгновенное давление. скорость потока.

Ультрафильтрационное концентрирование пробы завершается, когда объем жидкости сырья снижается до объема целевой концентрации.

 

2.2.7 Диализ

Поместите впускную трубу, трубу пополнения и возвратную трубу во впускной резервуар, поместите передающую трубу в контейнер для сбора и поставьте контейнер для сбора на весы для очистки.

Откройте обратный клапан, запустите впускной насос, откройте проходной клапан, отрегулируйте скорость насоса и TMP до соответствующего значения. Откройте подпиточный насос, поддерживайте объем жидкости в приемном резервуаре неизменным и начните диализ равного объема. Начните отсчет времени, когда жидкость попадает в контейнер, и запишите давление на впускном конце, обратном конце и массу жидкости в соответствующий интервал времени и получите мгновенную скорость потока путем расчета.

 

2.2.8 СИП

Сначала промойте буфером, затем промойте водой для инъекций (операция 2.2.3), затем очистите чистящим средством (операция 2.2.4) и, наконец, промойте водой для инъекций (операция 2.2.3).

 

2.2.9 Испытание водного потока

Операция заключается в следующем: 2.4.5.

 

2.2.10 Консервация мембранной кассеты

Кратковременное хранение (менее или равное 3 дням). Держите мембранную кассету в приспособлении и используйте раствор для хранения в цикле в течение 10–15 минут, закройте клапан системы, отключите электропитание жидкостного насоса и убедитесь, что что резервуар для подачи жидкости правильно закрыт.

Если срок хранения составляет от 3 дней до 1 месяца, извлеките мембранную кассету из приспособления и запечатайте ее в пластиковый пакет или другой герметичный контейнер. Добавьте примерно 50–100 мл раствора для хранения в пластиковый пакет или герметичный контейнер и закройте его. Или его можно погрузить непосредственно в раствор для хранения. В следующей таблице рекомендованы условия хранения.

 

3 Результаты и анализ

 

3.1 Исследование факторов, влияющих на эффективность удаления пирогенов

Рабочее давление ультрафильтрации: непрерывно обрабатывали 15 тестовых партий. В каждой партии давление фильтрации поддерживали на уровне 5, 10, 15 и 2{{10}}psi во время ультрафильтрации, а жидкость для сбора вируса концентрировали 30 раз и элюировали буферной жидкостью. (в 10 раз больше объема) в непрерывном потоке. Результаты показаны в таблице ниже: скорость удаления эндотоксина составила менее 87,0%, скорость восстановления антигена была стабильной на уровне 86,0%, а скорость удаления белка-хозяина была стабильной на уровне 90,0%, что указывает на что различное рабочее давление мало влияло на эффект восстановления антигена, удаления эндотоксина и удаления белка-хозяина.

Коэффициент концентрации ультрафильтрации: непрерывно проводили 15 тестовых партий. В каждой партии жидкость для сбора вируса концентрировали 30 раза, 50 раз, 80 раз и 100 раз соответственно во время ультрафильтрации. Давление фильтрации поддерживали на уровне 20 фунтов на квадратный дюйм, и буферную жидкость (10-кратный объем) элюировали непрерывным потоком. Результаты показаны в следующей таблице: скорость удаления эндотоксина колебалась от 53,3% до 86,9%, скорость восстановления антигена оставалась стабильной на уровне 86,0%, а скорость удаления белка-хозяина был стабильным на уровне 91,0%. При сегментированном отборе проб антиген не был обнаружен в растворе для передачи, а в концентрированном растворе вируса оставалось менее 10% белка хозяина. Концентрация эндотоксина в концентрированном растворе вируса увеличивалась с увеличением времени концентрации, а скорость удаления эндотоксина была самой высокой в ​​концентрированном образце в 80 раз, и производитель также мог учитывать концентрацию в 100 раз, что не только повысила эффективность производства и снизила стоимость, но также удовлетворила требования производства вакцин.

 

3.2 Истощение потока мембранной кассеты и очистка регенерации

После обработки степень восстановления мембранного потока составила 92,6%. Первая скорость восстановления новой мембранной кассеты является нормальной, в соответствии с текущими свойствами наблюдения за исходной жидкостью, последующим прогнозированием второго и NTH раз, скорость восстановления потока мембранной кассеты будет близка к данным после этой обработки, и имеют тенденцию быть стабильными. В течение 2 часов однократного использования истощение мембранной кассеты было идеальным, и только 10% мембранного потока было израсходовано в ходе общей эксплуатации.

3.2.1 Истощение флюса в процессе обработки мембранной кассеты

3.2.2 Результат очистки и регенерации мембранной кассеты

 

О гидлинге

 

Guidling Technology — национальное высокотехнологичное предприятие, специализирующееся на биофармацевтических препаратах, культурах клеток, очистке и концентрации биомедицинских препаратов, диагностике и промышленных жидкостях. Мы успешно разработали центробежные фильтрующие устройства, кассеты для ультрафильтрации и микрофильтрации, вирусный фильтр, систему TFF, глубинный фильтр, полое волокно и т. д., которые полностью соответствуют сценариям применения биофармацевтических препаратов, клеточных культур и т. д. Наши мембраны и мембранные фильтры широко используются в процессах концентрации, экстракции и разделения предварительной фильтрации, микрофильтрации, ультрафильтрации и нанофильтрации. Наши многочисленные линейки продуктов, от небольших одноразовых лабораторных фильтров до производственных систем фильтрации, тестирования на стерильность, ферментации, клеточных культур и многого другого, отвечают потребностям тестирования и производства. Guidling Technology надеется на сотрудничество с вами!