Полный анализ процесса производства препарата МРНК: как технология TFF решает проблемы очистки
В последние годы технология мРНК достигла прорывного прогресса в биофармацевтической области, продемонстрировав огромный потенциал применения, особенно в вакцинах и генной терапии. Успешная разработка мРНК-вакцин не только предоставила новые решения для профилактики инфекционных заболеваний и борьбы с ними, но также способствовала прогрессу в иммунотерапии рака и персонализированной медицине. Крупномасштабное производство мРНК, поскольку это новый класс терапевтических продуктов, представляет собой весьма сложную задачу, требующую контроля стабильности РНК, удаления остаточных ферментов и побочных продуктов реакции,-замены буфера и достижения высоких-скоростей восстановления чистоты, и все это требует технологий производства с использованием решений, одобренных регулирующими органами-.
Процесс производства мРНК-вакцин или терапевтических средств в основном делится на три этапа: приготовление основного раствора плазмидной ДНК, приготовление основного раствора мРНК и приготовление лекарственного продукта мРНК-ЛНЧ.
Блок-схема процесса производства лекарств мРНК
Тангенциальная поточная фильтрация (TFF) – хорошо зарекомендовавшая себя-технология мембранного разделения. Она широко применяется при производстве мРНК благодаря своей-эффективности молекулярного просеивания, контролируемому обмену буфера и низкому сдвиговому напряжению. В зависимости от конструкции мембранного модуля распространенные конфигурации TFF включают кассеты с плоскими-листами и модули с полыми-волокнами. Кроме того, мембранное разделение - под давлением в TFF можно разделить на микрофильтрацию (MF), ультрафильтрацию (UF), нанофильтрацию (NF) и обратный осмос (RO) в зависимости от размера пор мембраны с постепенно возрастающей селективностью.
TFF играет решающую роль на нескольких этапах производства лекарств на основе мРНК, включая подготовку массы плазмидной ДНК, массовое производство мРНК и окончательную рецептуру лекарственных препаратов мРНК-ЛНЧ. Благодаря соответствующему выбору типа мембраны, предельной-молекулярной массы (MWCO) и материала мембраны TFF позволяет эффективно удалять побочные-продукты реакции и низко-молекулярные-примеси, а также облегчает замену и концентрирование буфера как до, так и после инкапсуляции ЛНЧ. Это значительно повышает чистоту, стабильность и общую масштабируемость процесса РНК.
Кроме того, на производительность фильтрации с тангенциальным потоком влияют такие факторы конфигурации системы, как тип насоса и конструкция трубок, а также ключевые параметры процесса, включая трансмембранное давление (TMP), напряжение сдвига и фильтрационный поток. Эти факторы необходимо тщательно выбирать и оптимизировать на основе характеристик целевого продукта, особенно для чувствительных к стрессу продуктов, таких как мРНК-ЛНЧ, которые очень чувствительны к внешним механическим воздействиям во время обработки.
Очистка плазмидной ДНК
Приготовление маточного раствора плазмидной ДНК в основном основано на разработке последовательности матрицы транскрипции. Методы получения обычно включают амплификацию плазмидной ДНК, хотя также можно использовать амплификацию ПЦР. На примере амплификации ДНК удалось спроектироватькишечная палочкаобычно используется для амплификации-на основе ферментации. Последующий процесс очистки в основном включает сбор клеток, лизис и осветление, концентрирование и замену буфера, стерильную фильтрацию, линеаризацию и хроматографическую очистку. В промышленных условиях для сбора клеток часто используется центрифугирование с непрерывным-потоком, но оно создает относительно высокие силы сдвига. Системы полых волокон с открытыми каналами и низким сдвигом больше подходят для работы с образцами с высоким содержанием твердых веществ, высокой вязкостью или чувствительностью к сдвигу, такими как плазмидная ДНК. После сбора клетки подвергают гомогенизации под высоким-давлением, ультразвуковой обработке или щелочному лизису с последующим предварительным осветлением посредством глубинной фильтрации.
Чтобы облегчить последующую хроматографию, сначала для концентрирования и замены буфера часто используется тангенциальная проточная фильтрация (TFF) с использованием мембранных кассет или колонок с полыми волокнами с отсечкой молекулярной массы-30 кДа, 100 кДа или 300 кДа. Это уменьшает объем образца и одновременно удаляет некоторые примеси, такие как РНК, белки клетки-хозяина (HCP) и фрагменты ДНК клетки-хозяина (HCD). Хроматография служит основным этапом очистки. Обычно анионообменную хроматографию (AEX) комбинируют с хроматографией гидрофобного взаимодействия (HIC) для эффективного удаления примесей и обогащения высокобиоактивной сверхспиральной плазмидной ДНК, тем самым значительно улучшая чистоту плазмиды.
После очистки плазмиду снова подвергают воздействию TFF для концентрации раствора до целевой концентрации (обычно 0,5–2 мг/мл) и проведения диализа с конечным буфером хранения. На этом этапе из процесса удаляются остаточные соли и органические растворители, гарантируя, что буферная система соответствует требованиям для последующих реакций транскрипции in vitro (IVT).
Очистка мРНК, транскрибируемой in vitro (IVT)
Транскрипция и модификация in vitro (IVT) являются ключевыми процессами приготовления исходных растворов мРНК. При производстве мРНК IVT используется комбинация тангенциальной проточной фильтрации (TFF1) – хроматографии – тангенциальной проточной фильтрации (TFF2). Эта стратегия обеспечивает эффективную и-качественную очистку мРНК, обеспечивая критически важную поддержку для производства вакцин.
После завершения реакций транскрипции и модификации сначала обычно проводят ультрафильтрацию/диафильтрацию с использованием мембранных кассет или колонок из полых волокон с отсечкой молекулярной массы-30 кДа, 100 кДа или 300 кДа. На этом этапе из реакционной системы эффективно удаляются различные примеси,-связанные с процессом, такие как РНК-полимераза, остаточные фрагменты ДНК, непрореагировавшие NTP, кэпирующие ферменты, двухцепочечная РНК (дцРНК) и ингибиторы малых-молекул, одновременно обеспечивая замену буфера. После одного этапа фильтрации в тангенциальном потоке большинство примесей эффективно удаляются, и единственной обнаруживаемой остаточной белковой примесью является РНК-полимераза.
Впоследствии для дальнейшей очистки применяются несколько методов хроматографии. Обычно используемые методы включают аффинную хроматографию,-эксклюзионную хроматографию, ионную-парную обращенно--фазовую хроматографию и ион-обменную хроматографию. Благодаря такому сочетанию ультрафильтрации и последовательной хроматографии мРНК достигает высокого уровня чистоты.
Чтобы удовлетворить требования к рецептуре или хранению, исходный раствор мРНК снова концентрируют или разбавляют с использованием мембранных кассет 30 кДа, 100 кДа или 300 кДа или колонок с полыми волокнами, чтобы точно отрегулировать целевую концентрацию и заменить его в буфере для окончательного состава. Наконец, для контроля микробной нагрузки применяется стерильная-фильтрация, завершающая временное хранение и заполнение материала.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 ЛМХ).
Очистка составов мРНК-LNP
Липидные наночастицы (ЛНЧ) в настоящее время являются наиболее изученной системой доставки мРНК-терапевтических препаратов. В настоящее время различные составы мРНК-LNP находятся на разных стадиях доклинической и клинической разработки. ЛНЧ очень чувствительны к производственным процессам. Среди единичных операций, необходимых для производства мРНК-LNP, значительные проблемы представляют концентрация и замена буфера посредством тангенциальной проточной фильтрации (TFF), а также стерильная фильтрация. Эти шаги необходимо тщательно оптимизировать, чтобы обеспечить масштабируемость процесса и качество продукции, избегая при этом таких проблем, как загрязнение мембраны и неправильная загрузка фильтра.
После инкапсуляции мРНК для очистки используют тангенциальную проточную фильтрацию (TFF). Целью этого шага является удаление неинкапсулированной мРНК, свободных полимеров или липидных материалов, а также остаточных растворителей из мРНК и липидов. Поскольку мРНК-LNP проявляют ограниченную стабильность при комнатной температуре, оптимизация последующих процессов, включая TFF, имеет решающее значение для поддержания качества продукта.
Ключевые направления оптимизации включают в себя: соответствующую настройку трансмембранного давления (ТМР) и скорости тангенциального потока в зависимости от размера частиц и стабильности мРНК-ЛНЧ, чтобы сбалансировать эффективность фильтрации и стресс частиц; выбор мембран или колонок с полыми волокнами с подходящим пределом молекулярной массы-(MWCO, например, 100 кДа или 300 кДа) для эффективного удаления свободной мРНК, примесей и обменного буфера при минимизации адсорбции или повреждения частиц; и оптимизацию объемов концентрации и диафильтрации для обеспечения эффективной замены буфера в целевом составе и контроля конечной концентрации и дисперсности частиц.
Кроме того, критические показатели качества (такие как размер частиц, индекс полидисперсности [PDI] и эффективность инкапсуляции мРНК) должны тщательно контролироваться во время процесса, а параметры динамически корректироваться на основе данных в реальном-времени для достижения стабильной, масштабируемой и эффективной очистки и составления мРНК-LNP.
Кроме того, из-за нестабильности мРНК-ЛНЧ и их компонентов при методах терминальной стерилизации для удаления бактерий и других микробных загрязнений обычно используется стерильный фильтр- с размером пор 0,2 мкм.