Промышленный-процесс последующей очистки вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИКР) — раздел «Ультрафильтрация»
Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (ИБР) вызывается инфицированием вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИБРВ), также известным как вирус герпеса крупного рогатого скота типа 1 (BHV-1). Заболевание в основном характеризуется респираторными симптомами и абортами. Помимо этих клинических проявлений, ИБР может привести к снижению надоев молока у молочного скота и снижению привеса у мясного скота, что приводит к значительным экономическим потерям для животноводческих ферм.
Заболевание носит иммунодепрессивный характер. При протекании единичной инфекции ее патогенность относительно невысока; однако при возникновении смешанных инфекций с другими вирусными или бактериальными заболеваниями тяжесть и вред значительно возрастают. Вакцинация является наиболее эффективным методом профилактики и контроля. Доступны два основных типа вакцин: живые аттенуированные вакцины и инактивированные вакцины. В настоящее время используемые в хозяйствах вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота представляют собой преимущественно инактивированные вакцины.
Живые аттенуированные вакцины характеризуются сильной иммуногенностью, быстрым возникновением иммунитета и длительной продолжительностью защиты (обычно более шести месяцев). Их обычно используют для экстренной иммунизации во время вспышек заболеваний. Однако они несут потенциальный риск распространения вируса, представляют опасность для стельных коров и не могут использоваться у латентно инфицированного, но бессимптомного крупного рогатого скота.
Инактивированные вакцины характеризуются высокой безопасностью, не имеют риска выделения вируса или возврата вирулентности и считаются абсолютно безопасными. Их можно использовать для крупного рогатого скота на всех стадиях, включая стельных коров, телят и племенных быков. Однако формирование иммунитета происходит относительно медленно, а продолжительность защиты короче, поэтому обычно требуется повторная иммунизация. В некоторых случаях защитная эффективность может быть слабее, чем у живых аттенуированных вакцин.
Независимо от того, используется ли живая аттенуированная вакцина или инактивированная вакцина, последующий процесс очистки можно разделить на четыре основных этапа: сбор и осветление → концентрирование и первичная очистка → глубокая очистка → инактивация/стерильная фильтрация и составление рецептуры.
Концентрирование является ключевым этапом последующего процесса очистки вакцин, следующего сразу после осветления. Его основная цель – быстро превратить собранный большой-осветленный раствор с низкой-концентрацией вируса в форму небольшого-объема с высокой-концентрацией, сохраняя при этом вирусную биологическую активность. Это создает необходимые условия для последующих стадий тонкой очистки с высоким-разрешением, но низкой-емкостью, таких как хроматография.
Этот этап обычно выполняется с использованием ультрафильтрации с тангенциальным потоком (TFF). Принцип заключается в следующем: питательный раствор вируса течет параллельно поверхности ультрафильтрационной мембраны с определенным размером пор. Под давлением небольшие молекулы, такие как вода, соли и некоторые примеси, проходят через мембрану перпендикулярно и удаляются, в то время как неповрежденные вирусные частицы, размер которых намного превышает поры мембраны, сохраняются, непрерывно рециркулируют и концентрируются. По сравнению с традиционным высокоскоростным-центрифугированием этот метод более щаден для хрупких вирусов, таких как IBRV, имеющих липидную оболочку. Он эффективно уменьшает структурные повреждения вируса и потерю активности, вызванные высокими сдвиговыми силами, и более поддается линейному масштабированию-для промышленного производства.
Успешная операция по концентрации – это гораздо больше, чем просто уменьшение объема. Ключевые моменты оптимизации процесса включают: точный контроль трансмембранного давления и скорости потока сырья для балансировки эффективности фильтрации при минимизации концентрационной поляризации и загрязнения мембраны; выбор подходящего материала мембраны и размера пор для обеспечения высокого удержания вируса и потока пермеата; и нахождение оптимального баланса между восстановлением вируса, коэффициентом концентрации и временем обработки. Концентрированная вирусная суспензия не только достигает значительно более высокого титра, но и предварительно очищается за счет удаления большой части водорастворимых примесей. Это обеспечивает необходимую основу для объема и концентрации для последующих важных этапов очистки, таких как хроматография и нуклеазная обработка, что делает концентрацию центральным звеном эффективности всего последующего процесса.
Вторичная диафильтрация является критически важным этапом последующей очистки вакцины, проводимой после тонкой очистки и перед приготовлением препарата. Обычно его проводят после хроматографии и обработки нуклеазой. Его основной целью является не первоначальная концентрация, а замена системы и точная настройка условий конечного приготовления. Процесс выполняется в системе ультрафильтрации с тангенциальным потоком (TFF), где свежий чистый буферный состав постоянно добавляется к циркулирующему концентрированному вирусному раствору, в то время как исходный растворитель и низкомолекулярные примеси удаляются. Эта операция эффективно и бережно удаляет остаточные соли, органические растворители, продукты распада нуклеаз и следы растворимых примесей, оставшиеся после процесса очистки.
Ключевым моментом является поддержание постоянного объема или внесение незначительных корректировок концентрации, чтобы гарантировать, что концентрация вируса соответствует спецификациям состава. Для хрупких вирусов с оболочкой, таких как вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBRV), щадящая гидродинамическая среда вторичной диафильтрации имеет решающее значение для сохранения целостности частиц и иммуногенности. В конечном итоге этот этап обеспечивает прочную основу для последующей инактивации (если необходимо), добавления адъюванта или стабилизатора и окончательного наполнения, гарантируя, что конечный продукт попадет в рецептуру с определенными компонентами, в одинаковых условиях и с хорошей совместимостью. Таким образом, это один из основных шагов для обеспечения безопасности, стабильности и согласованности партий-в-партиях.
IBRV — это оболочечный двухцепочечный вирус с линейной-ДНК и оболочкой примерно сферической формы. Зрелые частицы IBRV имеют диаметр около 160–230 нм. Соответственно, использование ультрафильтрационных мембран 100, 300 или 500 кДа может удерживать IBRV, удаляя при этом некоторые загрязняющие белки. Степень восстановления ультрафильтрации мембранных кассет Jiuling Technology варьируется в зависимости от типа исходного материала, но обычно достигает 90–95%.