Краткое обсуждение нескольких уникальных методов использования полых волокон в очистке тел включений

Тельца включения (ТВ) представляют собой нерастворимые белковые частицы высокой плотности, обернутые мембранами, образующимися при экспрессии чужеродных генов в прокариотических клетках, особенно в Escherichia coli. При наблюдении под микроскопом ИБ представляет собой высокопреломляющую область, явно отличающуюся от других компонентов цитоплазмы.

Формирование телец включения является относительно сложным процессом, связанным со скоростью производства белка в цитоплазме, концентрация вновь генерируемых пептидов высока, и времени на сворачивание недостаточно для образования аморфных белковых агрегатов. Тельца включения в основном состоят из белков, более 50% которых являются клонированными продуктами. Первичная структура этих продуктов полностью правильная, но трехмерная конфигурация неправильная, поэтому биологическая активность отсутствует. Размер тела включения составляет 0,5-1мкм, нерастворим в воде, растворим только в денатурирующих веществах, таких как мочевина, гидрохлорид гуанидина и т. д.

У E. coli тельца включения могут встречаться в двух местах клетки: цитоплазме и периферической цитоплазме. Расположение и характеристики телец включения в клетке зависят от того, как экспрессируются белки.

Включения в цитоплазме E. coli обычно имеют диаметр от {{0}},2 до 1,5 мкм, а разные белки имеют разные диаметры, например, размер интерферона составляет 0,811 мкм, а размер прореннет составляет 1,281 мкм. В некоторых случаях диаметр некоторых телец включения больше диаметра E. coli, что придает E. coli выпячивание. Обычно клетка имеет только одно тело включения.

 

Включение в очищение организма

 

Процесс очистки тел включения обычно выглядит следующим образом:

Разрушение клеток:

Общая технология измельчения клеток: высокоскоростное измельчение тканей, гомогенизация в стеклянном гомогенизаторе, ультразвуковая обработка, метод многократного замораживания-оттаивания, химическая обработка (обычно с использованием обработки лизоцимом).

 

Включение мытья тела:

Тельца включения – это неактивные твердые частицы, образующиеся в результате внутриклеточной агглютинации белков, экспрессируемых бактериями, которые обычно существуют в аморфной, нерастворимой форме. В теле включения истинный целевой белок составляет лишь около 50%, а остальная часть содержит липиды, липополисахариды, нуклеиновые кислоты и гетеропротеины, которые связаны с тельцем включения и влияют на ренатурацию белка телец включения. Поэтому промывка перед денатурацией – очень необходимый шаг.

Кроме того, промывание телец включения помогает увеличить выход рефолдинга рекомбинантных белков. Удалив примеси, можно уменьшить препятствия в процессе ренатурации, благодаря чему белок можно будет более эффективно сворачивать и правильно собирать, тем самым улучшая активность и функцию белка‌.

При стирке обычно используется менее 1% нейтрального моющего средства, такого как Твин, Тритон, мочевина и NP40, а также ЭДТА и восстанавливающие агенты 2-меркаптотрейтол (ДТТ), -меркаптоэтанол, повторяемый много раз, поскольку моющая способность моющего средства увеличивается при увеличение ионной силы раствора, при промывке тел включения можно добавлять NaCl для повышения ионной силы.

Тельца включения можно использовать для удаления других компонентов раствора, разрушающего клетки, путем центрифугирования или фильтрации, в обоих случаях используются преимущества различных физических свойств тел включения.

 

Центрифугирование:

Белки телец включения значительно плотнее, чем фрагменты клеток того же объема, поэтому тело включения можно отделить от остальной части клетки с помощью центрифугирования. Непрерывное центрифугирование является наиболее часто используемой операцией получения телец включения в промышленном производстве. Поскольку плотность фрагментов клеток меньше, чем у тела включения, скорость седиментации меньше, чем у тела включения. Непрерывное суспензирование и центрифугирование позволяют центрифугировать большую часть телец включения, при этом фрагменты клеток постепенно удаляются.
Фильтрация (фильтрация с тангенциальным потоком): из-за различных размеров молекул тел включения и растворимых белков можно использовать метод фильтрации, который может снизить эксплуатационные расходы и облегчить масштабирование. Тангенциальная поточная фильтрация (TFF) осуществляется за счет разницы трансмембранного давления. Вещества и примеси, размер которых меньше размера пор мембраны, проходят через мембрану, в то время как примеси, такие как клетки с более крупными частицами, улавливаются. Размер отверстия мембраны, обычно используемого для фильтрационной промывки, составляет 0,1 мкм. Микрофильтрация с тангенциальным потоком из полого волокна может напрямую справляться с высоким содержанием твердых частиц в жидком материале, меньше шагов, простота в эксплуатации, мембрану можно использовать повторно посредством очистки, что снижает инвестиции в оборудование и эксплуатационные расходы в соответствии с требованиями модульного автоматизированного производства.

 

Ниже приводится пример применения промывки тел включений с использованием полых волоконных колонок Guidling.

Мы использовали полое волокно диаметром 94 см2 0.1-0.45 мкм для концентрации 250 мл жидкости (молекулярная масса целевого белка 17 кДа). В течение всего процесса промывания исследовали скорость восстановления целевого белка и истощение мембранного потока.

0-71мин — процесс концентрирования, 71-224мин — процесс промывки и фильтрации. В течение всего процесса микрофильтрации TMP постепенно увеличивалось, скорость подачи жидкости оставалась неизменной, а средний поток материала составлял 12LMH.

Результаты показали, что целевой белок был полностью захвачен, а степень восстановления целевого белка составила более 90%. Направляющие колонны из полого волокна устойчивы и подходят для этого применения.

 

Растворение тел включения:

Тельца включения обычно растворяются в условиях денатурирующего агента мочевины или гидрохлорида гуанидина, а растворенные белки телец включения полностью денатурируются, то есть, за исключением сохранения первичной структуры и ковалентных связей, все водородные связи и гидрофобные связи разрушаются, а гидрофобные связи боковые цепи полностью обнажены.

Мочевина и гидрохлорид гуанидина являются денатурантами средней силы, которые легко удаляются диализом и ультрафильтрацией. Общая концентрация мочевины 8-10М, гуанидина гидрохлорида 6-8М. Растворение мочевины имеет такие преимущества, как неионизация, нейтральность, низкая стоимость, удаление белка после ренатурации не вызывает большого количества осаждения белка, а растворенные тела включения можно очищать различными хроматографическими методами, поэтому оно широко используется. .

 

Рефолдинг белка телец включения:

Растворенный рекомбинантный белок должен быть правильно сложен, чтобы сформировать функциональный белок. Методы ренатурации включают разбавление раствора белка почти до нейтрального уровня, удаление денатуранта, ренатурацию на колонке и гель-фильтрационную хроматографию. Среди них разбавление раствора белка почти до нейтрального уровня и удаление денатуранта является распространенным классическим методом ренатурации, особенно метод ренатурации с разбавлением имеет самый высокий коэффициент использования.

Удаление денатуранта:

Диализ: Преимущество состоит в том, что объем не увеличивается, а скорость удаления денатуранта контролируется путем постепенного снижения концентрации внешней проницаемой жидкости, но это занимает много времени и легко образует неактивные белковые агрегаты, которые не подходят для диализа. крупномасштабная операция и не может быть применена в масштабах производства.

Ультрафильтрация (TFF): легко контролировать скорость диализа, будь то исследования и разработки, пилотные испытания или производство, позволяет удалять денатуранты (смена жидкости + концентрация) посредством ультрафильтрации (TFF).

 

Очистка белков телец включения:

Методы очистки белков после ренатурации аналогичны методам очистки растворимых белков: ионообменная хроматография, гель-фильтрационная хроматография, аффинная хроматография, высаливание сульфатом аммония и др.

Тельца включения не обладают биологической активностью, нет необходимости беспокоиться о потере активности белка, а большие объемы экспрессии не приведут к гибели клеток и максимизируют устойчивость к атаке протеазы. Полое волокно Jiuling можно гибко применять в последующих процессах очистки тел включения. На этапе промывки тела включения превосходная производительность по сравнению с центробежной промывкой, использование полого волокна микрофильтрации по технологии девяти лет для промывки с тангенциальной фильтрацией потока может значительно сократить время процесса, а общая степень восстановления может достигать более 90%. Полое волокно Jiuling также можно использовать на этапе ренатурации белков телец включения. Мутность питательной жидкости, отфильтрованной с помощью полого волокна микрофильтрации, будет значительно снижена, а степень извлечения белка будет высокой; Использование полого волокна для ультрафильтрации позволяет не только удалить денатуранты, но и сократить время загрузки хроматографического образца, чтобы сэкономить время, уменьшить объем наполнителя и снизить себестоимость продукции. Скорость восстановления полого волокна микрофильтрации/ультрафильтрации варьируется в зависимости от материалов, а общая скорость восстановления может достигать 90-95%.

Компания Guidling Technology приглашает вас запросить тестовые наборы для соответствующих обзоров.

 

О гидлинге

Guidling Technology — национальное высокотехнологичное предприятие, специализирующееся на биофармацевтических препаратах, культурах клеток, очистке и концентрации биомедицинских препаратов, диагностике и промышленных жидкостях. Мы успешно разработали центробежные фильтрующие устройства, кассеты для ультрафильтрации и микрофильтрации, вирусный фильтр, систему TFF, глубинный фильтр, полое волокно и т. д., которые полностью соответствуют сценариям применения биофармацевтических препаратов, клеточных культур и т. д. Наши мембраны и мембранные фильтры широко используются в процессах концентрации, экстракции и разделения предварительной фильтрации, микрофильтрации, ультрафильтрации и нанофильтрации. Наши многочисленные линейки продуктов, от небольших одноразовых лабораторных фильтров до производственных систем фильтрации, тестирования на стерильность, ферментации, клеточных культур и многого другого, отвечают потребностям тестирования и производства. Guidling Technology надеется на сотрудничество с вами!