Промышленная-очистка бактериофагов в промышленном масштабе — раздел «Осветление» и «Ультрафильтрация»
Бактериофаги, также известные как фаги, представляют собой вирусы, поражающие бактерии. Фаг не может выжить сам по себе; для размножения он должен паразитировать на бактерии-хозяине, что в конечном итоге приводит к лизису бактерии. Благодаря своим уникальным свойствам фаги могут использоваться в клинических целях для идентификации и типирования бактерий, а также для лечения некоторых рефрактерных бактериальных инфекций.
Это схематическая диаграмма структуры бактериофага (источник изображения: Интернет).
По оценкам, болезни растений ежегодно вызывают более 30% глобальных потерь урожая. Среди различных патогенов особенно трудно контролировать бактериальные заболевания. Традиционные методы борьбы в основном основаны на антибиотиках и препаратах на основе меди-. Однако чрезмерное использование антибиотиков привело к усилению устойчивости к противомикробным препаратам, а длительное-использование соединений меди приводит к их накоплению в окружающей среде, создавая риск для здоровья людей и животных.
Поскольку бактериофаги обладают высокой специфичностью, они могут избирательно убивать патогенные бактерии, не нанося вреда полезным микробам или другим клеткам-хозяевам. Таким образом, фаги могут служить альтернативой антибиотикам и препаратам на основе меди. С помощью фаготерапии можно эффективно уничтожить патогены, сократив при этом использование антибиотиков и соединений меди.
Благодаря постоянному научно-техническому прогрессу и более глубоким исследованиям бактериофагов перспективы использования фагов для лечения супербактерий становятся все более многообещающими. Ожидается, что в будущем фаготерапия станет одним из ключевых решений проблемы устойчивости к антибиотикам. Благодаря продолжающимся исследованиям и исследованиям фаготерапия может стать важной силой в области противомикробного лечения, внеся больший вклад в здоровье человека.
Однако для безопасного и эффективного введения бактериофагов в организм человека,-особенно посредством внутривенной инъекции-остается одна серьезная проблема:как получить сверх-препараты сверхчистых фагов.
Лизат фага представляет собой сложную смесь, которая, помимо целевых фагов, содержит основные примеси, такие как: бактерии-хозяева и их фрагменты, геномная ДНК и белки хозяина (примеси, связанные с хозяином-); эндотоксины, такие как липополисахариды (ЛПС) (примеси, связанные с процессом-); и примеси,-связанные с продуктом, включая пустые капсиды и обломанные хвосты.
Таким образом, целью очистки является не только достижение высокого титра фага, но и снижение примесей,-особенно эндотоксинов, ДНК хозяина и белков-до чрезвычайно низких уровней, как указано в стандартах фармакопеи.
Надежный и масштабируемый процесс очистки фагов обычно следует общим принципам последующей обработки и может быть разделен на следующие логические этапы:
Последующий процесс очистки бактериофагов
Осветление – удаление макроскопических примесей
На начальном этапе очистки бактериофага основной целью этапа осветления является эффективное удаление неповрежденных бактериальных клеток и крупных клеточных остатков из сырого лизата. Основная цель этого этапа — обеспечить чистое сырье для последующих хроматографических колонок или установок мембранного разделения, сводя к минимуму нагрузку твердых частиц. Это эффективно предотвращает засорение последующих блоков очистки, обеспечивая стабильную работу и высокую эффективность процесса на протяжении всего рабочего процесса очистки.
В традиционных процессах обработки бактериофагов осветление обычно основано на низкоскоростном-центрифугировании в сочетании с многоступенчатой глубинной фильтрацией-обычно последовательном прохождении через фильтры 0,8 мкм, 0,45 мкм и 0,22 мкм- для эффективного удаления остатков клеток-хозяев и примесей. Несмотря на то, что этот подход является зрелым и надежным, он включает в себя несколько этапов, требует-затрат времени и повторной передачи материалов, оставляя место для оптимизации общей производительности и эффективности.
Замена многоступенчатой-глубинной фильтрации накапсула для микрофильтрациипозволяет существенно упростить и интенсифицировать этот процесс. В частности, после удаления большей части клеточного мусора с помощью низкоскоростного-центрифугирования лизат можно непосредственно обработатьтангенциальная поточная фильтрация (TFF)с использованием капсул для микрофильтрации с определенным размером пор (0,45 мкм или 0,22 мкм). Это обеспечивает тонкое удаление твердых примесей и эффективное проникновение целевых фагов водин шаг, эффективно объединяя традиционные три ступени фильтрации в одну.
Это нововведение не только значительно сокращает время работы и ручное обращение, но также сводит к минимуму потери образцов и риск загрязнения, вызванный несколькими этапами фильтрации, тем самым улучшая общее извлечение фагов. Между тем, работа с тангенциальным потоком снижает загрязнение мембраны, увеличивает производительность и повышает надежность процесса.
Поэтому принятиеинтегрированная стратегия осветления, сочетающая низкоскоростное-центрифугирование и капсулы для микрофильтрациипредставляет собой эффективный подход к повышению эффективности и экономической-эффективности крупномасштабного-производства бактериофагов. Капсулы для микрофильтрации Guidling Technology обычно позволяют снизить мутность корма до уровня ниже20 НТУ, полностью отвечающий требованиям последующих стадий ультрафильтрации и хроматографии.
Улавливание и концентрация – первичная очистка и уменьшение объема
Во времязахват и концентрацияНа этапе очистки бактериофагов основной целью является эффективное извлечение фагов из больших объемов осветленного лизата при одновременном достижении концентрации первичного продукта и замены буфера. Этот шаг в первую очередь зависит отТангенциальная поточная фильтрация (TFF)технология.
Принцип TFF заключается в использовании ультрафильтрационных мембран с определенным пределом молекулярной массы-(обычно 100 или 300 кДа). Мелкомолекулярные примеси, такие как остаточные компоненты культуральных сред, метаболиты и небольшие белки, избирательно проходят через поры мембраны, тогда как фаги удерживаются в ретентате за счетЭффекты исключения размера, что позволяет их эффективное разделение и обогащение.
В системе TFFрежим ультрафильтрациииспользуется для достижения объемной концентрации при переключении нарежим диафильтрацииобеспечивает замену буфера, создавая тем самым подходящие физико-химические условия для последующих этапов, таких как ферментативная обработка.
Эта технология сочетает в себе преимуществавысокая эффективность обработкииотличная масштабируемость, что делает его идеальным для крупномасштабного-производства. По данным GuidlingTechnology, капсулы для ультрафильтрации обычно достигаютстепень восстановления фага 90–95%в зависимости от конкретного обрабатываемого материала.
Глубокая очистка – целенаправленное удаление критических примесей
При очистке бактериофаговглубокая очисткаявляется ключевым этапом, определяющим качество конечного продукта. Его основной целью являетсяспецифическое удаление критических примесей, такие как эндотоксины. ТрадиционныйЦентрифугирование в градиенте плотности CsCl-из-за своей токсичности и отсутствия масштабируемости-был исключен из промышленных процессов. Современные подходы сосредоточены натехнологии на основе хроматографии-, с инновационной интеграциейпредварительная обработка ферментами.
Продвинутая стратегия, сочетающаяанионообменная хроматография (АЭК)спредварительная обработка щелочной фосфатазой (AP)был разработан. И фаги, и липополисахариды (ЛПС) несут отрицательные заряды, что приводит к конкуренции за места связывания в обычных процессах AEC и вызывает ко-элюцию, которая снижает эффективность очистки. Вводя предварительную обработку AP перед загрузкой AEC, фермент специфически удаляет фосфатные группы из липида А и основных полисахаридных областей молекул ЛПС, значительно уменьшая их суммарный отрицательный заряд. Это эффективно ослабляет их сродство к анионообменной среде.
Экспериментальные данные показывают, что обработка образца20 Ед/мл АПс последующей очисткой с использованиемМембранные адсорберы с лигандом четвертичного амина (Q) или монолитные колонкиможет достичь доУдаление эндотоксинов на 98,8%, сохраняя при этом отличные показатели восстановления фагов. Этот подход успешно решает давнюю-проблему совместной-адсорбции эндотоксинов во время очистки фагов.
Полировка – окончательная доработка и формулировка
В финалеэтап полировкиПри очистке бактериофагов основной задачей является достижение максимальной чистоты и готовности рецептуры. Это включает в себя удаление следов остаточных примесей, исключение добавок, введенных в процессе (таких как щелочная фосфатаза), и полную замену продукта на буферную систему, совместимую с составом-.
Обычно это достигается посредствомвторичная диафильтрация, проверенный и эффективный метод, который позволяет как глубоко удалить мелкие-молекулярные загрязнения, так и провести тщательную замену буфера.
Чтобы еще больше повысить чистоту продукта,хроматография взаимодействия водородных-связейилисмешанная-хроматография (MMC)может быть представлен какзаключительный этап полировки. Эти методы используют механизмы многомерного разделения для удаления следовых компонентов с физико-химическими свойствами, аналогичными свойствам фага-мишени. В результате получается высокоочищенный активный фармацевтический ингредиент бактериофага (API), отвечающий строгим стандартам качества, необходимым длясоставы для инъекций-для инъекций.
При выборе комбинации мембранных модулей микрофильтрации и ультрафильтрации с площадью мембраны 1 м² расчетный максимальный объем бактериофага, который может быть переработан, достигает 100 л. Поток микрофильтрационного материала составляет примерно 20–50 лмч, а поток ультрафильтрационного материала – примерно 15–30 лмч. По сравнению с традиционными методами обработки этот подход может эффективно удовлетворить технологические требования как к осветлению, так и к ультрафильтрации.
Ссылки:
Сааведра и др.,Масштабируемая очистка препаратов бактериофагов (2025)
Лапрас и др.,Рационализация процесса очистки фагового активного фармацевтического ингредиента (2024)
