Последующий процесс ультрафильтрации/диафильтрации концентрирования: как эффективно предотвратить проникновение и потерю целевого белка

Последующий процесс концентрирования ультрафильтрации/диафильтрации: как эффективно предотвратить проникновение и потерю целевого белка

В последующих процессах очистки рекомбинантных белков, продуктов крови и других биологических препаратов ультрафильтрация/диафильтрация (УФ/ДФ) используется для концентрирования сырья, замены буфера и удаления солей и низкомолекулярных примесей. Разделение достигается за счет мембранного просеивания: крупные молекулы, такие как моноклональные антитела (мАт), удерживаются мембраной, в то время как соли, эндотоксины, свободные белки клеток-хозяев (HCP) и другие мелкие-молекулярные примеси проходят через мембрану и удаляются с пермеатом. При масштабировании процесса-может легко произойти потеря целевого белка через мембрану, что напрямую снизит выход продукции и увеличит стоимость партии. В некоторых рабочих условиях в пермеате может быть обнаружен белок, что требует быстрого определения того, являются ли вытекшие компоненты интактными целевыми моноклональными антителами, деградированными/фрагментированными агрегатами или белками клетки-хозяина. Эта статья разделена на две основные части: в ней рассматриваются традиционные подходы к управлению процессом-и в сочетании с планированием экспериментов (DOE) устанавливается надежное окно процесса, поддерживаемое множеством аналитических методов для определения идентичности белков, обнаруженных в пермеате.

 

 

I. Ключевые причины проникновения целевого белка через мембрану во время УФ/ДФ

1. Избыточное трансмембранное давление (ТМП)
Когда разница давлений на мембране слишком велика, сопротивление растворителя увеличивается, в результате чего некоторое количество мономерного белка попадает в пермеат. Во время-масштабирования питающий резервуар содержит больший объем материала, а колебания давления в трубопроводах более выражены, что делает переходное избыточное давление более вероятным, чем в лабораторном масштабе.

2. Неправильный тангенциальный расход.
Если скорость потока слишком мала, на поверхности мембраны образуется плотный концентрационный-поляризационный слой, и локальная концентрация белка может превысить порог толерантности мембраны. Если скорость потока слишком высока, напряжение сдвига может вызвать структурное расщепление моноклонального антитела, приводя к образованию более мелких фрагментов белка, которые могут свободно проходить через поры мембраны.

3. Чрезмерно высокая концентрация белка в сырье.
Когда концентрация белка в корме слишком высока, белок накапливается на поверхности мембраны, и некоторое количество мономерного белка может попасть в пермеат. Это распространенная проблема в крупномасштабном-производстве.

4. pH или проводимость вне рабочего диапазона.
Изменения зарядовых характеристик белка могут уменьшить его радиус гидратации и кажущийся размер частиц, что приведет к аномальному проникновению через мембрану.

5. Старение мембранной кассеты, высокий диффузионный поток или недостаточное предварительное-кондиционирование.
Физические дефекты мембранной кассеты могут напрямую вызвать утечку белка и представлять опасность,-связанную с оборудованием. Повторная мойка с использованием сильнощелочных растворов может постепенно повредить мембранный материал из полиэфирсульфона (ПЭС).

6. Чрезмерный объем диафильтрации.
Во время длительной диафильтрации непрерывная промывка растворителем может постепенно уносить небольшие количества мономерного белка.

 

II. Традиционные практические меры по предотвращению проникновения и потери целевого белка

(A) Управление параметрами процесса

1. Контроль трансмембранного давления (ТМР).
Определите верхний предел предупреждения о давлении и установите сигналы блокировки, чтобы предотвратить кратковременное воздействие высокого-давления на мембранный слой. После определения базовых параметров в небольшом масштабе уменьшите безопасное рабочее давление во время-масштабного производства и зарезервируйте соответствующий диапазон допусков процесса.

2. Оптимизация скорости перетока
Установите стабильный пограничный слой и уменьшите концентрационную поляризацию на поверхности мембраны за счет перекрестного потока, тем самым сводя к минимуму накопление белка на поверхности мембраны в источнике.

3. Ограничьте конечную концентрацию после концентрации.
Определите предел концентрации на основе физико-химических свойств белка и избегайте чрезмерной концентрации корма. Для моноклональных антител стандартная конечная концентрация обычно не превышает 50 мг/мл; для некоторых моноклональных антител, -склонных к агрегации, концентрацию следует дополнительно снизить.

4. Контролируйте pH и проводимость корма.
Поддерживайте стабильный размер гидратированных частиц белка и избегайте молекулярного сжатия, вызванного нарушениями кислотно-основной или ионной-силы.

(B) Оборудование и средства оперативного контроля

1. Выполняйте проверку целостности мембранной кассеты перед каждой партией.
Перед производством каждой партии проводите тест точки пузырька-, чтобы выявить поврежденные волокна мембраны. Поврежденные мембранные кассеты следует немедленно выбросить, чтобы предотвратить постоянную утечку белка.

2. Стандартизировать процедуру CIP-мойки.
Контролируйте концентрацию NaOH и время контакта. После сильнощелочной очистки полностью уравновесьте материал мембраны, чтобы снизить риск деформации пор мембраны.

3. Используйте поэтапную диафильтрацию.
Используйте замену буфера-большого объема на ранней стадии, чтобы удалить соли, и замедляйте скорость диафильтрационного потока по мере приближения к конечной точке, чтобы уменьшить сопротивление и потерю белка.

 

III. Создание пространства для проектирования процессов через DOE (характеристика процесса QbD; применимо к подаче IND)

1. Факторный скрининг
Проверьте пять ключевых параметров процесса УФ/ДФ (P): трансмембранное давление, скорость потока сырья, начальную концентрацию белка, pH сырья и рабочую температуру.
Переменные отклика: сохраняемый выход, содержание белка в пермеате, мембранный поток и процент высокомолекулярных-агрегатов.

С помощью анализа значимости определите ключевые факторы, которые способствуют утечке белка.

2. Моделирование поверхности отклика
Выберите четыре параметра с наивысшей значимостью, чтобы построить поверхность отклика и проанализировать взаимодействие между параметрами. Во многих условиях эксплуатации один параметр может оставаться в допустимом диапазоне, тогда как комбинация двух параметров может привести к проникновению белка. Такие эффекты взаимодействия невозможно выявить с помощью традиционных экспериментов с одним-фактором-в--времени. На основе модели определите работоспособное пространство проектирования. Пока параметры процесса остаются в этом диапазоне, можно обеспечить эффективное удержание белка при удалении примесей путем диафильтрации.

3. Наихудший-случай (требуется для характеристики процесса)
Выберите параметры процесса на крайних рабочих границах, чтобы смоделировать производственную изменчивость: максимальное TMP, минимальную скорость перекрестного потока и верхний-предельный предел концентрации белка. Убедитесь, что даже в экстремальных условиях эксплуатации не происходит крупномасштабной-потери целевого белка, что соответствует требованиям проверки CMC.

 

IV. Множественные аналитические методы для идентификации белков, обнаруженных в пермеате, и различения целевых моноклональных антител, фрагментов деградации и HCP

В зависимости от аналитической эффективности, стоимости и сценариев подачи в регулирующие органы методы можно разделить на две категории: быстрый скрининг и подтверждающее тестирование. Быстрые методы должны быть приоритетными для повседневного мониторинга процессов; при возникновении аномальных отклонений следует использовать точные методы идентификации.

1. УФ-спектрофотометрия (быстрый онлайн-скрининг; предпочтителен для повседневного мониторинга цехов-)
Соберите пермеат и измерьте его поглощение A280. Это позволяет только определить, присутствует ли белок в пермеате, но не позволяет определить вид белка. В основном он используется для текущего мониторинга процессов. Постоянно увеличивающееся значение А280 указывает на усиление утечки белка и требует немедленной приостановки диафильтрации и исследования процесса.

2. SDS-PAGE-электрофорез (наиболее часто используемый метод качественной идентификации)
Используйте восстанавливающий и не-восстанавливающий электрофорез и сравните положения полос с положениями целевых моноклональных антител в исходном сырье:
1) Если положение полосы полностью соответствует целевому mAb, интактное mAb проникло через мембрану.
2) Если появляются полосы с более низкой-молекулярной-массой, это означает, что белок подвергся гидролитическому расщеплению с образованием фрагментов моноклонального антитела.
3) Если полосы разбросаны по множеству разных полос, большинство из них представляют собой белки клетки-хозяина (HCP) из клеток-хозяев E. coli/CHO, а не целевой продукт.

3. Высокоэффективная-размерная-эксклюзионная хроматография (HPSEC).
Разделите компоненты по размеру молекул и сравните время их элюирования со временем элюирования исходного сырья:
- Основной пик с тем же временем удерживания, что и у моноклонального антитела, указывает на интактный целевой белок.
- Пик, элюирующийся раньше, указывает на агрегаты/фрагменты с высокой-молекулярной-массой.
- Пик, элюирующийся позже, указывает на фрагменты разложения с низкой-молекулярной-массой.
- Отсутствие характерного основного пика указывает на примесь белков HCP.
Этот метод может предоставить количественные данные и может быть включен в отчеты о расследовании отклонений от процесса; он имеет высокое признание в материалах для клинических заявок.

4. Тестирование белка клетки-хозяина HCP- с помощью набора ELISA.
Если в пермеате обнаружен белок, результат ELISA повышен, а HPSEC не показывает характерного пика моноклональных антител, то вытекший материал можно в основном определить как белки клетки-хозяина CHO. Это указывает на неполное удаление примесей во время предварительной очистки; примеси вымываются на этапе УФ/ДФ и не приводят к потере продукта.

5. Проверка аффинной хроматографии (хроматография на белке А)
Белок А специфически связывает Fc-область моноклональных антител. Загрузите образец пермеата в колонку: появление характерного пика элюирования указывает на наличие интактного целевого антитела; отсутствие пика элюирования показывает, что все белки в пермеате являются примесными белками.

6. Масс-спектрометрия (ЖХ-МС) (углубленная прослеживаемость; используется для исследования основных отклонений процесса)
ЖХ-МС позволяет напрямую анализировать аминокислотную последовательность и точно определять происхождение белка. Он в основном используется для исследования сложных или необычных отклонений и не используется в качестве рутинного испытания при-контроле процесса.

V. Корректирующие действия, соответствующие различным результатам анализа

1. Интактное целевое моноклональное антитело обнаружено в пермеате.
Снизить трансмембранное давление и конечную концентрацию после концентрирования; сузить рабочий диапазон процесса по результатам ДОЭ; и проверьте целостность мембранной кассеты.

2. Фрагменты деградации антител, обнаруженные в пермеате.
Изучите напряжение сдвига на протяжении всего процесса и экстремальные значения pH; оптимизировать предварительный этап инактивации вируса, чтобы уменьшить расщепление белка.

3. В пермеате обнаружены только примесные белки HCP.
Никакой регулировки параметров UF/DF не требуется. Проследите проблему до предыдущих этапов хроматографии и улучшите удаление примесей во время аффинной и ионообменной хроматографии.

 

VI. Краткое содержание

Чтобы предотвратить утечку белка во время УФ/ДФ, традиционное управление процессом опирается на исторический опыт для определения параметров отдельных точек, которые могут адекватно обеспечить стабильное мелкомасштабное-производство. Чтобы обеспечить стабильную производительность при поэтапном масштабировании-процесса, необходимо использовать характеристику процесса на основе Министерства энергетики-, чтобы определить пространство проектирования процесса с достаточной допуском. Интервальное управление параметрами-может компенсировать производственные различия. Как только белок обнаружен в пермеате, простая система УФ-детектирования может выдать первоначальное предупреждение, после чего следует электрофорез, HPSEC и ELISA для отслеживания и идентификации. Это позволяет точно дифференцировать целевой продукт от примесей-клетки-хозяина, позволяя целенаправленно исследовать-причины и принимать корректирующие действия. Это также стандартизированный исследовательский компонент, который в настоящее время включен в документацию CMC для проектов mAb.