Краткое содержание:

В этой статье рассматриваются два ключевых фактора, которые необходимо учитывать в стратегиях очистки белка: требования к применению нижестоящих по течению и биологические характеристики самих белков. В статье подчеркивается, что высококачественная очистка белка является основой для надежности и повторяемости экспериментальных данных, особенно для производства рекомбинантных белков. Различные сценарии применения имеют особые требования к чистоте, активности или содержанию эндотоксина белков, а характеристики белков могут значительно повлиять на стратегии очистки. Согласно конкретным случаям, статья показывает, что уникальные белки должны принять индивидуальные схемы очищения. Наконец, был предложен системный процесс производства белка (рис. 1), подчеркивая полный контроль качества полного процесса при выборе систем экспрессии, конструкции конструкции для оптимизации очистки и рекомендации оценки гомогенности и функциональности белка с помощью биофизических методов (таких как SEC-MALS, DSF и т. Д.). Эта статья направлена ​​на то, чтобы предоставить практическое руководство для исследователей, помогая им сформулировать эффективные и повторяемые стратегии очистки, основанные на характеристиках и требованиях к применению целевых белков, что повышает качество и эффективность научных исследований.

 

Рисунок 1. Схематическая диаграмма процесса производства белка

 

Производство белка с высоким спросом - примеры идентификации проблем, дизайн стратегии смягчения и соответствующий выход

 

1. Связывание на белке снуклеиновой кислоты:

При очищании белков, связывающих нуклеиновую кислоту, необходимы несколько стадий для удаления загрязнения нуклеиновой кислоты. Во время лизиса необходимо добавить нуклеазы (такие как SM -нуклеаза (бензоназа®) или DNASE или RNASE), но связанные нуклеиновые кислоты не могут быть полностью удалены. Замените этапы удаления нуклеиновой кислоты, такие как осаждение сульфата PEI или стрептомицина, очистка гепарина или ионообменная хроматография. Присутствие нуклеиновых кислот контролировали с помощью отношения A26 0 nm/a28 0 nm на протяжении всего процесса очистки. Если соотношение было ниже 0,6, оно показало, что чистота белка была относительно высокой, а загрязнение нуклеиновой кислоты было минимальным. Для белков с сильно связанными нуклеиновыми кислотами они могут быть временно денатурированы (такие как обработанные мочевиной), а затем вновь а затем. Ключевые моменты: используйте высококачественные реагенты, свежие буферы и чистые колонны (чистка с 0,5 М NAOH перед использованием).

 

2. Тяжелая цепь ферритина мыши:

Целью продуцирования очищенного белка для тяжелой цепи ферритина мыши является белок одночастической крио-электронной микроскопии с высоким разрешением (Cryo-EM). Вектор экспрессии Escherichia coli, кодируемый немеченым MFTH1, был ультразвуковой нарушен без добавления нуклеазы. После нагрева при 7 0 степень, он перенеса осаждения сульфата аммония, диализа и этапов исключения размера хроматографии. Полученный образец показал наличие большого количества загрязняющих веществ на изображениях криоэлектронной микроскопии (рис. 2а), что было совершенно непригодным для его применения. Оптимизируйте шаги. Добавьте SM -нуклеазу во время процесса лизиса клеток и процесса диализа после осаждения сульфата аммония, а затем добавьте стадию анионной обменной хроматографии, чтобы уменьшить отношение A26 0 нм/A280 нм с 1,4 до 0,8. После хроматографии исключения размера соотношение A260NM/A280NM от конечного образца MFTH1 составило 0,56. Изображения микроскопии SDS-PAGE и криоэлектронной микроскопии (рис. 2B) показали, что белок был очень чистым, что указывает на то, что загрязнители были эффективно удалены.

Рисунок 2 Тяжелая цепь мыши ферритина

 

 

 

3. Химерный белок человеческий dsrbec (dsrbd-egf-himera):

DSRBEC образуется путем слияния двухцепочечного домена связывания РНК (DSRBD) человеческой протеинкиназы R и эпидермального фактора роста человека (HEGF). Когда DSRBD экспрессируется в Escherichia coli, он показывает чрезвычайно высокую способность связывать дцРНК. После лизиса клеток загрязненная РНК будет препятствовать связыванию рекомбинантных белков с колонкой с аффинной ионной аффинной металлом (IMAC). Традиционные методы, такие как осаждение сульфата PEI или стрептомицина, обработка РНКазы или растворы с высоким содержанием соли не могут удалить РНК. Лизис клеток проводили с использованием буфера, содержащего 4M мочевины. Супернатант загружали в колонку IMAC, а от 4 м до 0 M мочевину медленно использовали в течение ночи (рентуаркация столбца). Буфер ренатурации добавляли с помощью имидазола и элюировали из колонны IMAC. Окончательная уточнение проводилась через гель -фильтрацию SuperDex 75 для получения функционально активного DSRBEC.

 

4. белки, связанные с двухвалентными катионами или другими кофакторами:

Для белков, которые взаимодействуют с двухвалентными катионами, такими как Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+, или другие кофакторы, важно добавить специфические дивалентные катионы (или другие кофакторы) во время выражения. Небольшое количество одинаковых дивалентных катионов (или других кофакторов) также требуется в процессе очистки. Однако использование любых хелатирующих агентов (таких как EDTA, EGTA) и хелатирующих восстановительных агентов (таких как DTT или DTE) следует избегать. При работе с белками, связанными с двухвалентными катионами, для подтверждения фактического присутствия дивалентных катионов (или других кофакторов) в очищенном белке должна использоваться смесь ингибиторов протеазы (или других кофакторов).

 

5. рекомбинантный ферридоксин (RFD), содержащий один кластер [2FE ± 2S] из термофильных цианобактерий Mastigocladus laminosus

Ферридоксин является растворимым железом-сальфурским белком, который участвует в реакциях переноса электронов. Ферроререредоксин типа растений несет один кластер [2FE ± 2S] в качестве электронного акцептора фотосистемы I. Штамм Escherichia coli BL21 (DE3) экспрессировал рекомбинантный белок RFD в среде ТБ, содержащую 10 мм FECL3 и антибиотики. Элюирование колонки захвата IMAC проводили с использованием буфера, содержащего 10 мм гистидина, чтобы избежать имидазола, и предотвратить разрушение кластера [2Fe ± 2S]. Анионовый обмен и исключение размера хроматография использовали для дальнейшей очистки и концентрации до 12 мг/мл для скрининга кристаллизации. По сравнению с рекомбинантным выработкой феррорельоксина, натуральный феррорельоксин, очищенный от сине-зеленых водорослей Mastigocladus laminosus, достиг более высокого разрешения во время кристаллизации.

 

6. белки, используемые в качестве антигенов

Белки часто используются в качестве антигенов для восстановления целевых лигандов. Первое, что нужно рассмотреть, это то, используется ли белок для иммунитета in vivo для получения обычного моноклонального или поликлонального IgG или для программ, включающих Camel IgG или процессы отбора IgG или in vitro.

 

6.1 Антигены, используемые для обработки антител

Когда антигены используются для получения моноклональных антител IgG, правильное складывание антигена обычно не требуется, потому что большинство моноклональных антител распознают линейные эпитопы, которые не сильно влияют на структуру антигена, и даже денатурированные антигены (такие как белки тела включения) остаются эффективными. Тем не менее, чистота должна строго контролироваться, чтобы избежать сильных иммуногенных загрязнений, мешающих иммунному ответу, и вызывая доминирование нецелевых антител.

 

6.2 Скрининг сопряженной библиотеки

Особое внимание следует уделять поддержанию естественной конформации антигена во время обработки библиотеки нанободий, полученной в результате иммунизации верблюда. В отличие от обычных антител, верблюжьи антитела (особенно наноболи) имеют тенденцию распознавать структурные эпитопы, которые связаны с их уникальной структурой выпуклых комплементарных сайтов. Точно так же при скрининге крупных синтетических или природных библиотек антител in vitro антиген должен поддерживать структуру, которая полностью согласуется с целевым применением. Поскольку сам процесс скрининга не смещен, если антиген имеет неправильную сворачивающую, агрегацию или конформационную гетерогенность, может быть проверено большое количество конъюгатов, нацеленных на не натуральные эпитопы.

 

 

 

7. белки, содержащие межмолекулярные или внутримолекулярные дисульфидные связи или свободный цистеин

Дисульфидные связи имеют решающее значение для стабилизации естественной структуры белков. Во время процесса очистки, когда очищающие белки, содержащие межмолекулярные или внутримолекулярные дисульфидные связи, необходимо избежать добавления восстановительных агентов, чтобы предотвратить конформационные изменения белков, тем самым изменяя их функции. Для белков, содержащих свободный цистеин, восстанавливающие агенты являются незаменимыми на всех этапах процесса очистки, особенно во время хранения, для предотвращения образования искусственных дисульфидных связей. Наиболее часто используемыми восстановительными агентами являются Dithiothreitol (DTT), -mercaptoethanol (-me) и Tris (2- карбоксиэтил) гидрохлорид фосфина (TCEP). Для смол IMAC, которые несовместимы с DTT или TCEP, рекомендуется использовать -ME и заменить их на другие восстановительные агенты в последующих шагах.

 

8. Фрагмент рекомбинантных антител

Хотя структура фрагментов рекомбинантных антител (таких как нанободии) проще, чем у IgG, их функция зависит от правильного образования дисульфидных связей. В бактериальных системах экспрессии, даже с принятием стратегий оптимизации, все еще могут возникать неправильно свернутые или частично сложенные продукты, которые существуют как в растворимой части, так и в теле включения. Более скрытым является то, что даже правильно сложенные фрагменты антител могут образовывать растворимые агрегаты (коллоидные агрегации) через гидрофобные бляшки на поверхности. Такие агрегаты трудно идентифицировать в обычных функциональных тестах (таких как ELISA), потому что мультивалентное связывание может маскировать снижение аффинности мономера, но их присутствие может серьезно повлиять на приложения, которые зависят от размера малых молекул (такие как микроскопия супер-разрешения). Следовательно, полагаться исключительно на SDS-PAGE недостаточно для оценки качества выборки. Биофизические методы, такие как гелевая фильтрация (рис. 3), должны быть приняты для различения мономеров (основных пиков) от агрегатов (пики объема исключения). Ключевые контрольные точки включают в себя: оптимизацию окислительно -восстановительной среды во время выражения, чтобы способствовать формированию дисульфидной связи и оптимизации условий хранения после очистки для предотвращения агрегации. Эти меры имеют решающее значение для обеспечения монодисперсности и функции фрагментов антител.

Рисунок 3. Отделение гель -фильтрации растворимых агрегатов нанободов

 

9. Растворимые фрагменты рецептора лимфоцитов LLT1

Рекомбинантная экспрессия дисульфидных связей-зависимых белков (таких как рецептор лимфоцитов LLT1) часто сталкивается с трудностями складывания. Гель фильтрация LLT1 дикого типа показала пики агрегации и пики димера (рис. 4А), но масс-спектрометрия выявила неправильное сворачивание, вызванное непарным цистеином в димере (рис. 4B). Для этой цели были разработаны два мутанта: один снял проблему цистеин, что привело к внезапному снижению урожайности (рис. 4А); После введения неоцистеина для реконструкции соответствующей дисульфидной связи мутант не только имел высокий выход и хорошую стабильность, но и может кристаллизоваться (рис. 4C), а трехмерная структура подтвердила, что мутант сформировал правильную дисульфидную связь и поддерживает естественное складывание. Этот случай демонстрирует, что путем рационального проектирования конформных дисульфидных связей, в сочетании с анализом гелевой фильтрации и масс -спектрометрии, проблема складывания рекомбинантных белков может быть эффективно решена, и могут быть получены функциональные белки со стабильными структурами и высокими выходами.

Рисунок 4. Реконструкция дисульфидной связи улучшает складывание и выход растворимого LLT1

 

 

 

10. Легко скорплатируемые белки

Очистка рекомбинантных белков часто сталкивается с проблемой агрегации, а его образование следует механизму «нуклеации»-сначала образуется небольшое количество растворимых агрегатов, а затем запускает крупномасштабную нерастворимую агрегацию. Чтобы решить эту проблему, необходимо принять многоуровневые стратегии: на стадии экспрессии это может быть достигнуто путем оптимизации штамма, снижения температуры культивирования, использования модифицированных культурных сред или различных солюбилизирующих слитых белков и замены систем экспрессии (клетки насекомых/млекопитающих) и т. Д. На стадии очистки, быстрая операция (в 4-градусной среде), которая требуется, чтобы избежать концентрации из натуральной белки, и т. Д. SEC) следует принять для быстрого удаления агрегатных ядер. Вообще говоря, при рассмотрении растворов буфера скрининга, таких как состав компонента, значение pH, диссоциивающее агент или растворие (рис. 5). Благодаря тонкой оптимизации ортогонального обнаружения (например, SEC, CD, LS, DSF и температурный сдвиг в зависимости от тепла флуоресценции и т. Д.) Были определены качество белка и наиболее подходящий буферный раствор.

Рисунок 5. Стратегии облегчения агрегации белка

 

11. Кристаллизация человеческой киназы CLK1 (как получить воспроизводимые партии)

Чтобы получить гомогенную нефосфорилированную киназу CLK1 для исследований кристаллизации, была принята мульти стратегия-схема совместной работы. Во -первых, он был совместно экспрессирован с λ -фосфатазой в Escherichia coli, чтобы устранить гетерогенность аутофосфорилирования. Хотя выход был снижен, было обеспечено полное дефосфорилирование. После захвата IMAC элюент дополняли стабилизаторами (50 мм аргинина, 50 мм глутаминовой кислоты и 10 мм DTT), чтобы предотвратить агрегацию, концентрированную, а его метка удаляли путем пищеварения TEV. Затем правильный олигомер был разделен с помощью SEC (содержащий 5% глицерина и -ME). Окончательный важный этап анионового обмена различает кристаллические (нефосфорилированные) и некристаллические (частично фосфорилированные) группы CLK1. Особенно стоит отметить, что способ лизиса клеток значительно влияет на стабильность белка-метод высокого давления и высокотемпературного метода приводит к необратимой агрегации CLK1, подчеркивая важность легкого лечения при препарате киназы.

 

 

 

12. Создание галектина -1 со стабильной способностью связывать лиганд

Чтобы подготовить функциональный галектин -1 для исследований связывания лиганда, стратегии экспрессии и очистки четырех конструкций (немеченые и меченные HIS-меченные галектин дикого типа -1, был сравнивал немеченые и меченные HIS-меченые мутант-галектин -1). Ключевые результаты указывают на то, что очистка аффинной хроматографии лактозы может эффективно скринировать для правильных сложенных белков, но ее необходимо объединить с тщательным диализом (буфер HEPES), чтобы полностью удалить лактозу из сайта связывания и восстановить активность CRD. Галектин дикого типа -1 подвержен окислению и инактивации, и его стабильность остается ограниченной даже в присутствии восстановительных агентов (рис. 6). Однако мутант без цистеина значительно повышает долгосрочную стабильность, сохраняя при этом сопоставимую активность агглютинации и термическую стабильность (проверенную NanoDSF, ITC и т. Д.), Удаляя зависимость дисульфидной связи.

Рисунок 6. Гидродинамическая характеристика рекомбинантного галектина -1 показывает его нестабильность

 

13. Удаление эндотоксина

Метод удаления эндотоксина основан на аффинной хроматографии, включая положительно заряженную хроматографию (анионный обмен), использование поликационных лигандов (таких как поли-L-лизин (PLL), иммобилизованный полиамин (полимиксин B)), и добавление поверхностно-коричневого Triton X {2}}. Во время процесса очистки обратите внимание на подготовку буферного раствора с водой без LPS и используйте новые столбцы или столбцы, которые использовались только в других очистках без LPS. Для загрязнения эндотоксина хроматографический насос/жидкость может инкубировать в течение ночи в 0. 5m NaOH или в течение 4 часов в 1. 0 m NaOH. Конечное количество LPS в образце оценивали с использованием лизатного реагента лизата лизата Limulus (LAL), и было подтверждено, был ли он ниже предела, необходимого для конкретного применения.

 

14. белковой комплекс

Экспрессия и очистка белковых комплексов должны быть оптимизированы в соответствии с конкретными условиями. Проблемы включают нестабильность или неправильное сворачивание субъединиц. Каждая субъединица может быть экспрессирована независимо и собрана in vitro или коэкспрессированная для образования функциональных белковых комплексов. Конструкция строительства должна быть тщательно введена с помощью меток очистки или обнаружения, чтобы не мешать сборке, особенно когда сложная информация ограничена и требуется множественная оптимизация. В процессе очистки необходимо оценить целостность и стабильность комплекса. Методы включают SDS-PAGE (обнаружение субъединиц), SEC (однородность), SEC-MALS (анализ молярной массы), массовую фотометрию или природную масс-спектрометрию (проверка массы). Следует отметить, что комплекс может диссоциации при низких концентрациях. В настоящее время необходимо оптимизировать хроматографический метод или буфер (например, с помощью термического дрейфа или условий скрининга DSF). Кроме того, снижение стадий очистки может предотвратить потерю слабых субъединиц взаимодействия и сбалансировать эффективность очистки и целостность комплекса.

 

 

 

15. Очистка комплексов антиген-антител

Комплексы антител-антиген являются типичными примерами белковых комплексов. Их совместная кристаллизация может выявить паттерны связывания и направлять оптимизацию инженерии антител. Традиционные методы требуют отдельной очистки антигенов и антител, а затем их смешивания. Тем не менее, недавние исследования показали, что стратегии совместной экспрессии и совместной работы более эффективны. Для получения комплекса требуется только одна очистка, и в то же время нестабильные антигены могут быть стабилизированы с помощью антител, и может быть достигнута даже безменная экспрессия. В этой конкретной ситуации SDS-PAGE и гель-фильтрация (SEC) обычно достаточны для оценки чистоты и качества комплекса.

 

Краткое содержание

Очистка белка является фундаментальной технологией в научных исследованиях. Производство белков академического масштаба обычно следует за стандартными стратегиями и может производить растворимые белки на уровне миллиграмма, которые широко используются в структурной биологии, биохимии и функциональных исследованиях. Тем не менее, особые требования к нижестоящим приложениям (например, необходимость отсутствия эндотоксина в экспериментах на животных и отсутствие загрязнения нуклеазой в исследованиях нуклеиновых кислот) или неотъемлемые характеристики белков (таких как легкая агрегация, содержащая дисульфидные связи или сродство нуклеиновой кислоты), часто требуются настраиваемые растворы. В этом обзоре, в ответ на эти особые обстоятельства, предлагается уточненные стратегии, начиная от выбора систем экспрессии, проектирование конструкций (оптимизации меток и границ доменов) до процесса очистки и вводятся контроль качества (например, SEC, SDS-PAGE, обнаружение деятельности и т. Д.) На ключевых этапах. Некоторые приложения также требуют дополнительного анализа (такого как обнаружение эндотоксина и определение остатков нуклеиновых кислот), аналогично концепции «обеспечения качества» (QA) в биофармацевтической промышленности, то есть для предотвращения дефектов через систематические процессы. Сформулируя руководящие принципы контроля качества и разъясняя конкретные стандарты для белковых реагентов, используемых в научных исследованиях, цель состоит в том, чтобы установить более строгие нормы очистки белка для академических лабораторий, повысить надежность и повторяемость экспериментальных данных и преодолеть разрыв между фундаментальными исследованиями и промышленными стандартами.

 

Doi: 10.1186/s 12934-022-01778-5