Литература поля|Попрощаться со сложным очистком? Новый метод поверхностно -активного вещества TFF + повышает эффективность и снижает затраты на производство вектора AAV
Генная терапия быстро развивается, однако ее высокая стоимость остается основным барьером, предотвращая более широкий доступ пациентов. Среди ключевых факторов этой стоимости - сложный производственный процесс Adeno - ассоциированных вирусных векторов (AAV). Исследование, опубликованное в биотехнологии и биоинженерии, разработало новый метод очистки, объединяющий фильтрацию тангенциального потока (TFF) с поверхностно -активными веществами, который обещает упростить процесс очистки AAV и снизить затраты. Давайте углубимся в это исследование, возглавляемое командой из Университета Токио.
1. ПРЕИМОТОРЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ: Проблемы и текущее состояние очистки AAV
Векторы AAV стали «звездными» инструментами доставки в генной терапии благодаря их высокой безопасности, низкой иммуногенности, способности заразить как делящихся, так и не - делящихся клеток, а также способность к долгом - термин -экспрессии генов. Тем не менее, их производственный процесс является сложным, в частности, шаги очистки вниз по течению, которые обычно включают в себя множество раундов центрифугирования и хроматографии. Эти методы - время - потребление, лейбористы - интенсивный, трудно масштабировать и дорогостоящий.
В лабораторных масштабах очистка часто зависит от хлорида цезия или градиента плотности йодиксанола ультрацентрифугирование, что является сложным для масштабирования для промышленного производства. Аффинная хроматография все чаще используется, но условия низкого уровня pH, которые требуются, могут ухудшить вирусную инфекционность. Следовательно, разработка простого, эффективного, нежного и масштабируемого метода очистки AAV имеет решающее значение.
Фильтрация тангенциального потока (TFF) - это размер - Метод разделения на основе, обычно используемый для концентрации и буфера - обмена биопродуктами. Тем не менее, обычный TFF обладает ограниченной способностью удалять примеси, такие как белки клеток -хозяев (HCP) и ДНК во время очистки AAV, часто оставляя агрегаты белка.
2. Инновационный подход: TFF в сочетании с поверхностно -активными веществами для эффективной очистки
Чтобы преодолеть ограничения традиционных TFF, исследователи Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa и коллеги в Университете Токио разработали умную стратегию: использование поверхностно -активных веществ для ингибирования агрегации и взаимодействия примеси, что позволяет им пройти через ультрафильтрационную мембрану (500 KDA Cutfular Catforcular), в то время как в стиле ультрафильтрационная мембрана (500 KDA Cutfulartaular Pireculars Wireclatration Membrane (500 KDA COFFULACLACLACERE), в то время как в составе ультрафильтрационной мембраны. размер).
Они проверили три типа поверхностно -активных веществ:
- Non - Ionic:Октил глюкозид
- Анионный:Натрий дезоксихолат
- ZwitterIonic:Парня
Исследование показало, что использование не - только ионного поверхностно -активного вещества было неэффективным. Как анионные дезоксихолаты натрия, так и цвиттерионные парни значительно усиливали удаление остаточных белков, и они нацелены на различные популяции белка. В конечном счете, сочетание 0,5% дезоксихолата натрия с 1% CAP дало замечательные результаты, почти полностью устраняя остаточные белки -хозяина. Анализ страницы SDS - показал только три чистых полосах белков AAV (VP1/VP2/VP3).
Рисунок 1. Процесс очистки TFF без поверхностно -активных веществ;(a) sds - page gel electrophores; (б) Просматривая электронная микроскопия (ПЭМ)
Рисунок 1. Процесс очистки TFF с поверхностно -активными веществами;(a) sds - page gel electrophoresis; (b) Прописывающая электронная микроскопия (TEM)
3. Результаты исследований: высокая чистота, активность и безопасность
- Эффективное удаление примесей:Новый метод достиг 99,98% удаления HCP и 95% удаления ДНК, с чистотой, сопоставимой или превышением с аффинной хроматографией.
- Улучшенная инфекционность:Эксперименты in vitro показали, что векторы AAV1 очищены с использованием этого метода, инфицированного клетками HEK293 более эффективно, чем те, которые очищены с помощью аффинной хроматографии (24,9% против 20,8%), что указывает на лучшее сохранение вирусной биоактивности.
- Хорошая безопасность in vivo:После локальной инъекции очищенных векторов AAV1 в скелетные мышцы мыши не наблюдалось значительного воспаления или повреждения тканей после двух недель, демонстрируя хорошую безопасность in vivo.
- Широкий серотип применимость:Метод успешно очистил несколько серотипов -, включая AAV1, AAV5, AAV8 и AAV9-FRO-культура клеточной культуры. Однако для AAV2, который в основном существует в клеточных лизатах с высокой примесей нагрузки, необходима дальнейшая оптимизация.
4. Резюме и перспективы
В этом исследовании разработал простой, быстрый (1,5 часа), эффективный и масштабируемый новый процесс очистки AAV. Объединив дезоксихолат натрия и парни, он успешно рассмотрел заражение остаточной агрегации белка во время очистки TFF.
Преимущества метода включают:
- Избегание жестких условий с низким уровнем рН, лучше сохранение вирусной активности
- Сокращение этапов хроматографии, упрощение рабочего процесса и экономия времени и затрат
- Легко масштабируемая, подходит для промышленного большого - масштабного производства
- Предоставление новой стратегии очистки других биомакромолекул, таких как экзосомы, другие вирусы и рекомбинантные антитела
Ограничения тока включают субоптимальное вирусное восстановление и неспособность отделять пустые капсиды от полных вирусных частиц, предполагая, что его наилучшее использование может быть в качестве первого - шага в многоэтажном рабочем потоке-.
В заключение, это исследование предлагает новый привлекательный вариант для выпущенного векторного производства AAV и может значительно снизить стоимость лекарств для генной терапии, что облегчает их более широкое применение.