Меры предосторожности при использовании ультрафильтрационной трубки
(1) Выберите подходящую пробирку для ультрафильтрации. Как правило, сохраняемая молекулярная масса не должна превышать 1/3 молекулярной массы целевого белка. Например, если молекулярная масса целевого белка составляет 35 кДа, можно выбрать пробирку для ультрафильтрации с молекулярной массой 10 кДа. Если молекулярная масса целевого белка составляет около 10 кД, можно использовать пробирку для ультрафильтрации с молекулярной массой 3 кД. Внимательно прочтите инструкцию по эксплуатации и обратите внимание на различную устойчивость ультрафильтрационной мембраны к различным химическим веществам.
(2) Недавно купленная ультрафильтрация сухая. Добавьте сверхчистую воду перед использованием, и вода полностью пройдет через мембрану. Предварительно охладите его на ледяной бане или в холодильнике в течение нескольких минут. Затем слить воду и добавить белковый раствор. Добавляемое количество не должно превышать белую линию в верхней части пробирки. Операция должна быть легкой. Перед добавлением белкового раствора пробирку для ультрафильтрации необходимо поместить на лед для предварительного охлаждения.
(3) Баланс. И масса, и центр тяжести должны быть сбалансированы. Обратите внимание, что скорость и ускорение не должны быть слишком высокими, иначе ультрафильтрационная мембрана будет напрямую повреждена. Начать центробежную ультрафильтрацию (предварительное охлаждение центрифуги до 4 градусов). После того, как обороты разных центрифуг преобразуются в G, они разные. Отрегулируйте ускорение центрифуги до самой низкой передачи, чтобы уменьшить давление на мембрану. Обратите внимание, что вы должны дождаться, пока центрифуга достигнет целевой скорости, прежде чем покинуть центрифугу, иначе, если возникнет проблема с центрифугой, вы не сможете решить ее в первый раз. Направление мембраны и вращающегося вала следует отрегулировать в соответствии с инструкциями (в случае центрифуги с угловым вращением мембрана перпендикулярна валу). При практическом использовании скорость обычно ниже, чем в руководстве, что может продлить срок службы центробежной трубы.
(4) Когда он сконцентрируется до оставшегося 1 мл, возьмите 50 мкл буферного раствора и добавьте 10 мкл, чтобы пропустить через него, чтобы увидеть, станет ли он синим, чтобы определить, протекает ли белок из пробирки для ультрафильтрации. Если трубка негерметична, слейте верхний слой и пропустите через новую трубку и начните ультрафильтрацию. Чтобы точно определить, не протекает ли пробирка, отцентрифугируйте ее с 5 мг мл БСА в течение 10 минут, затем отфильтруйте поток, пропустите белковый клей или Бредфорд для грубого измерения и продолжайте добавлять оставшийся раствор белка для концентрации (работайте на льду, чтобы белок не растворился). нагревают) до тех пор, пока не будут добавлены все концентрированные растворы. Обратите внимание на то, не происходит ли осаждение белка во время центрифугирования, что приводит к закупорке трубы. Если происходит выпадение осадка, определите конкретную причину выпадения осадка: слишком высока ли концентрация белка или неподходящий ли буфер; Первую проблему можно решить путем одновременной ультрафильтрации с несколькими ультрафильтрационными пробирками для снижения концентрации. Последнее заключается в смене различных буферных растворов до тех пор, пока белок не выпадет в осадок.
(5) Предыдущие шаги используются для концентрирования белка. Если вы хотите изменить буфер, когда общий белковый раствор сконцентрируется примерно до 1 мл, аккуратно добавьте новый буфер (ультрафильтрация через ультрафильтрационную мембрану 0.22 мкм), а затем концентрируйте примерно до 1 мл три раза подряд. Конечный объем последней концентрации зависит от требуемой концентрации белка, которая обычно не превышает 500 мкл, или может быть сконцентрирована до менее чем 200 мкл. В соответствии с объемной концентрацией не менее 10 раз каждый раз она может достигать более 1000 раз в три раза, что в основном может достичь цели смены буфера.
