Исследование процесса осветления ферментативного лизата высокой плотности рекомбинантной Escherichia Coli
Для того чтобы уменьшить помехи материальной жидкости для хроматографии и улучшить извлечение целевого белка, был изучен процесс осветления ферментационного лизата высокой плотности двух штаммов рекомбинантной Escherichia coli. Были выбраны штаммы BL21-HP1036 и BL21-palA, экспрессирующие ключевые гены Streptococcus suis и Haemophilus parasuis. Для оценки выхода белка с помощью мутности и электрофорезного обнаружения использовались процесс тангенциального потока, процесс высокоскоростного центрифугирования и процесс осветления мембранной кассеты.
Результаты показали, что лизат ферментации высокой плотности BL21-HP1036, BL21-palA, экспрессирующий ключевые гены Streptococcus suis и Haemophilus parasuis, был очищен с помощью мембранной кассетной фильтрации и центрифугирования, а выход белка составил более 80%, что позволило эффективно снизить хроматографические помехи и повысить скорость восстановления.
Введение
В настоящее время Streptococcus suis (SS) и Haemophilus parasuis (HPS) являются наиболее распространенными возбудителями бактериальных заболеваний на свиноводческих фермах, которые приносят свиноводству большие убытки. SS можно разделить на 35 серотипов 1-34 и 1/2, а HPS можно разделить на 1-15 серотипов, и эти два типа часто смешиваются, в основном вызывая у свиней полисерозит, артрит, менингит, эндокардит, бактериальную септицемию и бронхит.
Из-за большого количества серотипов Streptococcus suis и Haemophilus parasuis перекрестная защита между различными серотипами слабая, а при лечении антибиотиками значительно возрастет устойчивость к антибиотикам, что повлияет на терапевтический эффект.
Вакцины стали одним из эффективных средств профилактики SS и HPS. Существуют инактивированные вакцины, ослабленные вакцины, живые вакцины, субъединичные вакцины и генно-инженерные вакцины, но на рынке в основном представлены инактивированные вакцины и ослабленные вакцины, и их иммунная защита хороша, но перекрестная защита не очевидна. Субъединичная вакцина — это новый тип вакцины против streptococcus suis, который является новым типом вакцины с сильной перекрестной защитой и низкой ценой. Исследования и разработка субъединичных вакцин Streptococcus suis и Haemophilus parasuis обеспечивает идеальное решение проблем профилактики и контроля Streptococcus suis и Haemophilus parasuis, которые преследуют свиноводческую промышленность в Китае.
Субъединичные вакцины Streptococcus suis и Haemophilus parasuis подвергаются ферментации высокой плотности рекомбинантной Escherichia coli. Очищение лизата оказывает большое влияние на выход целевых белков, но соответствующих отчетов мало. Как реализовать этап очищения процесса ферментации и очистки - важная работа. В этой статье рекомбинантная E. coli BL21-HP1036, BL21-palA ферментация высокой плотности в качестве объекта для изучения того, как эффективно снизить мутность осветляющего раствора, улучшить выход белка для процесса ферментации субъединичной вакцины Streptococcus suis для достижения промышленной технологии дробления и очищения, чтобы обеспечить теоретическую основу и техническую поддержку.
1. Материалы и методы
1.1 Материалы
1.1.1 Штаммы
Штаммы Streptococcus suis и Haemophilus parasuis BL21-HP1036, BL21-pa-lA
1.1.2 Основные среды и реагенты
Дрожжевой экстракт и морская свинья; Хлорид натрия; Канамицин, IPTG; Формальдегид из; Набор для электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE).
1.1.3 Основное испытательное оборудование
Ферментер высокой плотности; Высокоскоростная центрифуга; Аппарат для электрофореза; Система визуализации ультрафиолетового геля; Ультразвуковая дробилка; Малая высокоскоростная центрифуга; Ультрафиолетовый спектрофотометр; Встряхивающий стол с постоянной температурой; Оборудование для аффинной хроматографии.
1.2 Методы
1.2.1 Высокоплотная ферментационная культура
Квалифицированные рекомбинантные штаммы кишечной палочки BL21-HP1036 и BL21-pa-lA были инокулированы на синтетической среде в концентрации 2% (об./об.) и культивировались при температуре 37 градусов в течение 35-40 часов.
1.2.2 Экспрессия, индуцированная рекомбинантным белком
Когда раствор ферментации достигал OD{{0}}±0.1, началась индукция, температура индукции составляла 35 градусов ±0,5 градуса, и культивирование было завершено через 10 часов индукции.
1.2.3 Гомогенное дробление под высоким давлением и центрифугирование
Бактериальная жидкость, прошедшая тест на инактивацию, была измельчена гомогенизатором высокого давления для разрушения клеток соответственно с давлением 100~150 МПа. После измельчения измельченная жидкость хранилась при низкой температуре.
Супернатант получали с помощью центрифуги с высокой скоростью, скорость центрифуги: 15000 об/мин, контроль температуры: 10°C ~ 15°C, скорость впрыска: 0,5~1 л/мин, соответственно, супернатант собирали, и супернатант заполняли контейнеры, в которых удаляли эндотоксин.
1.2.4 Микрофильтрационная мембранная кассетная очистка
Мембрану промывали 10л очищенной воды в одном направлении и проводили тангенциальную проточную фильтрацию. 300 мл разрушенной бактериальной суспензии после центрифугирования отбирали из центрифуги трубопровода и осветляли с помощью кассеты микрофильтрационной мембраны 0,45 мкм. Мутность измеряли путем отбора проб соответственно, и сравнивали мутность после центрифугирования, мутность осветленной жидкости в кассете микрофильтрационной мембраны и мутность концентрированной жидкости в кассете микрофильтрационной мембраны. Содержание белка в образце определяли с помощью хроматографии и электрофореза для оценки выхода белка.
Шаг 2: Результаты
2.1 Уточненные данные и результаты испытаний белков BL21-HP1036 и BL21-palA
Результаты на ФИГ. 1 показывают, что мутность жидкости дробления BL21-HP1036 и BL21-palA рекомбинантной Escherichia coli снизилась с 4 500 NTU и 4 000 NTU до 1970 NTU и 520 NTU соответственно после центрифугирования в пробирке. Мутность BL21-HP1036 и BL21-palA рекомбинантной Escherichia coli снизилась до 25 NTU и 1,28 NTU методом микрофильтрационной мембранной кассеты. Видно, что использование микрофильтрационной мембранной кассеты с тангенциальным потоком и оптимизированного канала открытого потока оказывает хорошее влияние на снижение эндотоксинов, вязкости и мутности хроматографической жидкости по сравнению с традиционной центрифужной фильтрацией, а также может значительно снизить количество разрушенного рекомбинантного гетеропротеина E. coli и нуклеиновой кислоты.
2.2 Восстановление белка из образцов BL21-HP1036 и BL21-palA
Таблица 1 показывает, что рекомбинантный белок Escherichia coli BL21-HP1036 присутствует как в очищенном микрофильтрацией растворе, так и в концентрированном супернатанте, покрытом микрофильтрационной мембраной, а общий выход белка после извлечения белка из очищенного микрофильтрацией раствора и концентрированного супернатанта составляет около 88,5%. Белок BL21-palA также присутствует в очищенном микрофильтрацией экссудате и супернатанте концентрированного раствора, покрытого микрофильтрационной мембранной кассетой. Общий выход белка BL21-PALa составил 81,5%.
3. Заключение
В данной работе штаммы, экспрессирующие ключевые гены BL{{0}}HP1036 и BL21-palA Streptococcus suis и Haemophilus parasuis соответственно, подверглись ферментации высокой плотности и прошли 0,45 Мутность жидкого материала была значительно снижена с помощью процесса микрофильтрации с использованием мембранной кассеты, что указывает на то, что технология фильтрации с тангенциальным потоком с использованием микрофильтрационной мембранной кассеты лучше, чем с использованием высокоскоростной центрифуги, и может значительно снизить содержание примесного белка и нуклеиновой кислоты в разрушенной рекомбинантной Escherichia coli.
После сбора прозрачной жидкости в одинарной кассете микрофильтрационной мембраны было 62,9%. Поскольку 37,1% целевого белка BL21-HP1036 представляли собой концентрат микрофильтрации или присутствовали в кассете микрофильтрационной мембраны и других потерях, для осветления был принят двухэтапный метод. На первом этапе для осветления и сбора экссудата использовалась кассета микрофильтрационной мембраны 0,45 мкм; на втором этапе оставшаяся концентрированная жидкость собиралась после центрифугирования в пробирке, а двухэтапно осветленная жидкость объединялась в качестве хроматографического образца. Значение мутности ферментационной жидкости BL21-palA существенно не увеличивалось, выход белка мог достигать более 85,5%, а выход белка ферментационной жидкости BL21-Pala мог достигать 81,5% после двухэтапной обработки.
Что касается выбора кассеты с микрофильтрационной мембраной, Guidling Technology может предоставить вам высококачественные решения. Наши серии кассет с микрофильтрационной мембраной и кассет с ультрафильтрационной мембраной используют полиэфирсульфон в качестве носителя, специально разработанного для биотехнологий. Наша полиэфирсульфоновая мембрана обладает такими преимуществами, как высокая пропускная способность, низкая адсорбция белка, высокая механическая прочность, ударопрочность и т. д. Мы предоставляем вам специальные зажимы для мембран для измерения давления на входе и выходе в режиме реального времени и можем обеспечить технические визиты в соответствии с вашими потребностями для настройки вашей специальной системы ультрафильтрации/микрофильтрации. Такая небольшая система с тангенциальным потоком может использоваться для малого, пилотного и мелкосерийного производства и может быть полностью линейной амплификации для полного соответствия вашим требованиям к испытаниям и производственным требованиям.
О Гуидлинге
Guidling Technology — это национальное высокотехнологичное предприятие, специализирующееся на биофармацевтике, клеточной культуре, очистке и концентрации биомедицинских, диагностических и промышленных жидкостей. Мы успешно разработали центробежные фильтрующие устройства, кассеты для ультрафильтрации и микрофильтрации, вирусный фильтр, систему TFF, глубинный фильтр, полое волокно и т. д., которые полностью соответствуют сценариям применения биофармацевтики, клеточной культуры и т. д. Наши мембраны и мембранные фильтры широко используются при концентрации, экстракции и разделении предварительной фильтрации, микрофильтрации, ультрафильтрации и нанофильтрации. Наши многочисленные линейки продукции, от небольших одноразовых лабораторных фильтров до систем производственной фильтрации, испытаний на стерильность, ферментации, клеточной культуры и т. д., отвечают потребностям тестирования и производства. Guidling Technology с нетерпением ждет сотрудничества с вами!
