Как выбрать подходящую пробирку для ультрафильтрации
Пробирки для ультрафильтрации, обычно используемые для концентрации белка и замены буфера, часто используются в пробирках для ультрафильтрации. Существуют и другие модели, которые имеют разные размеры объема и ультрафильтрационные пробирки в зависимости от молекулярной массы целевого белка, объема до концентрирования и целевого объема концентрирования. Многоразовый.
1. Выберите подходящую пробирку для ультрафильтрации, в основном учитывая MWCO и объем концентрации. Как правило, молекулярная масса не должна превышать 1/3 молекулярной массы целевого белка. Если молекулярная масса целевого белка составляет около 10 кД, можно использовать пробирку для ультрафильтрации с остаточной молекулярной массой 3 кД.
2. Недавно купленная ультрафильтрация сухая. Добавьте воду милликв перед использованием. Вода полностью проходит через мембрану и предварительно охлаждается на ледяной бане или в холодильнике в течение нескольких минут. Затем вылейте воду, чтобы добавить белковый раствор. Количество белкового раствора не должно превышать белую линию в верхней части пробирки. Простота в эксплуатации. Перед добавлением белкового раствора пробирку для ультрафильтрации необходимо вставить в лед для предварительного охлаждения.
3. Баланс. Масса и центр тяжести должны быть сбалансированы. Обратите внимание, что скорость и ускорение не должны быть слишком высокими, иначе ультрафильтрационная мембрана будет напрямую повреждена. Начать центрифужную ультрафильтрацию (предварительно охладив центрифугу до 4 градусов). Направление диафрагмы и вращающегося вала можно отрегулировать в соответствии с инструкциями (в случае угловой центрифуги диафрагма перпендикулярна валу). При фактическом использовании общая скорость ниже указанной в руководстве, что может продлить срок службы центробежной трубы.
4. после концентрирования до оставшегося 1 мл [возьмите 50 мкл бытового раствора Брэдфорда, добавьте 10 мкл жидкости, чтобы увидеть, станет ли она синей, и определите, не пропускает ли пробирка для ультрафильтрации белок. Если пробирка негерметична, перелейте ее в верхний слой, а затем перелейте обратно в новую пробирку, чтобы начать ультрафильтрацию. Чтобы точно определить, протекает ли пробирка, пожалуйста, 5 мг 10 минут центрифугируйте 10 минут, затем пропустите ее, пропустите белковый гель или Бредфорд] [грубое измерение]. Продолжайте добавлять оставшийся белковый раствор в концентрат (работайте на льду, чтобы предотвратить нагревание белка), пока не будут добавлены все концентрированные растворы. Во время центрифугирования обращайте внимание на то, не происходит ли осаждение белка и не вызывает ли это закупорку пробирки. Если происходит выпадение осадка, определите конкретную причину выпадения осадка: слишком высока ли концентрация белка или не подходит ли буфер; В первом случае можно решить, используя несколько пробирок для ультрафильтрации одновременно, чтобы уменьшить концентрацию, в то время как во втором можно менять разные буферы до тех пор, пока белок не осаждается.
5. Предыдущие шаги используются для концентрирования белка. Если буфер необходимо заменить, когда общий раствор белка сконцентрируется примерно до 1 мл, осторожно добавьте новый буфер (ультрафильтрация через ультрафильтрационную мембрану 0.22 мкм), а затем непрерывно концентрируйте примерно до 1 мл три раза, так что что конечная концентрация зависит от требуемой концентрации белка, которая обычно составляет не более 500 мкл или менее 200 мкл. В соответствии с объемной концентрацией не менее 10 раз каждый раз, это более чем в 1000 раз больше, чем в три раза, что в основном может достичь цели смены буфера.
6. Удалите конечный белковый концентрат. Работа на льду. С помощью желтого наконечника пипетки (200 мкл) осторожно вставьте наконечник пипетки вдоль края, затем аккуратно подуйте и перемешайте белковый раствор. Будьте осторожны, чтобы не коснуться ультрафильтрационной мембраны. Отсасывайте концентрированный раствор по 200 мкл каждый раз, пока он полностью не отсосется. Извлекать последний концентрированный раствор на дно пробирки не нужно, иначе это будет слишком сложно и можно повредить ультрафильтрационную мембрану. Наконец, в пробирку для ультрафильтрации добавляют воду милликв., минуя ультрафильтрационную мембрану, чтобы предотвратить потерю воды и высыхание мембраны.
7. Ниже приведены этапы обработки пробирки для ультрафильтрации и повторного использования пробирки для ультрафильтрации.
8. Налейте воду в пробирку для ультрафильтрации и несколько раз осторожно промойте милликвартальной водой. [если на дне пробирки наблюдается явное осаждение белка, можно сначала добавить воду, а затем сдуть ее пипеткой. Будьте осторожны, чтобы не коснуться мембраны. Осадок свисает вниз, а затем убегает. Водой из-под крана не смоешь. После добавления 0,2 м раствора NaOH поместите его при комнатной температуре на 20 минут и уравновесьте пробирку для ультрафильтрации в течение этого периода. Центрифугировать еще 10 минут. Вылейте оставшийся раствор NaOH и погрузите ватный сердечник в химический стакан (1 или 2 л) с водой Milliq, поместите на несколько часов, а затем замените новой водой, поместив на несколько часов, чтобы постоянно разбавлять концентрацию NaOH. Вымойте пробирку объемом 50 мл и залейте водопроводной водой, а внутреннюю стенку промойте милликвартальной водой.
9. Выньте погруженный сердечник пробирки, добавьте его в полную милликв. воды, а затем заполните пробирку на 50 мл милликв. водой. Медленно поместите сердечник трубки в 50 мл.
Отцентрифугируйте пробирку, слейте и разделите воду, затем накройте крышкой и храните при температуре 4 градуса до следующего использования. Вообще говоря, в соответствии с вышеуказанными шагами и мерами предосторожности ни одна трубка не сломается в течение трех или четырех лет.